Có nhiều lý do để kiểm tra tế bào và mô của con người dưới kính hiển vi. Nghiên cứu y học và sinh học được củng cố bởi kiến ​​thức về cấu trúc và chức năng bình thường của tế bào và mô cũng như các cơ quan và cấu trúc mà chúng tạo nên. Ở trạng thái khỏe mạnh bình thường, các tế bào và các thành phần mô khác được sắp xếp theo mô hình đều đặn, dễ nhận biết. Những thay đổi gây ra bởi một loạt các ảnh hưởng hóa học và vật lý được phản ánh bằng những thay đổi trong cấu trúc ở mức độ vi mô, và nhiều bệnh được đặc trưng bởi những bất thường về cấu trúc và hóa học điển hình khác với trạng thái bình thường. Xác định những thay đổi này và liên kết chúng với các bệnh cụ thể là cơ sở của mô bệnh học và tế bào học, những chuyên ngành quan trọng của y học hiện đại. Kính hiển vi đóng một vai trò quan trọng trong huyết học (nghiên cứu về máu), vi sinh học (nghiên cứu về vi sinh vật bao gồm ký sinh trùng và vi rút) và rộng hơn là trong các lĩnh vực sinh học, động vật học và thực vật học. Trong tất cả các ngành này, mẫu vật được kiểm tra dưới kính hiển vi.

Kính hiển vi

Có nhiều dạng kính hiển vi khác nhau, nhưng loại được sử dụng phổ biến nhất là kính hiển vi “trường sáng”, trong đó mẫu vật được chiếu sáng bằng nhiều tia sáng xuyên qua nó (ngược lại với chùm tia điện tử như trong kính hiển vi điện tử). Các yêu cầu chung để một mẫu vật được kiểm tra thành công bằng kính hiển vi trường sáng là:

• Các tế bào và các thành phần khác trong mẫu vật được bảo quản ở trạng thái “life-like” (quá trình này được gọi là “cố định”)
• Mẫu vật trong suốt chứ không mờ đục nên ánh sáng có thể xuyên qua nó
• Mẫu vật mỏng và phẳng nên chỉ có một lớp tế bào duy nhất
• Một số thành phần đã được nhuộm màu (nhuộm) khác nhau để có thể phân biệt rõ ràng

Tùy chọn chuẩn bị mẫu

Do các yêu cầu về kính hiển vi, các lựa chọn chuẩn bị mẫu vật bị giới hạn ở:

• Dán lam toàn bộ, trong đó toàn bộ sinh vật hoặc cấu trúc đủ nhỏ hoặc đủ mỏng để đặt trực tiếp lên một lam kính (ví dụ: một sinh vật đơn bào hoặc đa bào nhỏ hoặc một màng có thể được kéo căng mỏng trên một lam kính để quan sát dưới kính hiển vi)
• Kỹ thuật ép mẫu, trong đó các tế bào được ép hoặc nghiền trên một phiến kính để quan sát cấu trúc của chúng (ví dụ, ép các mẫu thực vật để phân tích nhiễm sắc thể)
• Phết tế bào, trong đó mẫu vật bao gồm các tế bào phân tán trong chất lỏng (ví dụ: máu, tinh dịch, dịch não tủy hoặc nuôi cấy vi sinh vật) hoặc nơi các tế bào riêng lẻ được gạt, chải hoặc hút từ bề mặt hoặc từ bên trong một cơ quan. Xét nghiệm phết tế bào là cơ sở của “xét nghiệm Pap” phổ biến được sử dụng để sàng lọc ung thư cổ tử cung ở phụ nữ
• Cắt mẫu, chuẩn bị mẫu để tiến hàng cắt lát, sau đó đặt chúng lên lam kính và nhuộm màu để quan sát dưới kính hiển vi. Chuẩn bị mẫu được thực hiện bằng cách sử dụng thiết bị vi phẫu mô tế bào.

Trong số các tùy chọn này, chỉ có các phần dán lam và phần cắt có thể bảo tồn cấu trúc giữa các tế bào riêng lẻ và các thành phần ngoại bào. Các kỹ thuật ép mẫu và phết tế bào cung cấp thông tin chi tiết về từng tế bào và số lượng tế bào tương đối, nhưng các mối quan hệ về cấu trúc bị mất. Việc chuẩn bị các mặt cắt là phương pháp phức tạp nhất về mặt kỹ thuật vì nó đòi hỏi thiết bị chuyên dụng và kiến ​​thức chuyên môn đáng kể. Việc kiểm tra bằng kính hiển vi các phần do bác sĩ giải phẫu bệnh thực hiện là nền tảng của chẩn đoán ung thư. Mặc dù phương pháp chuẩn bị các phần từ nguyên liệu động vật và thực vật là tương tự nhau, mô tả sau đây liên quan đến mô động vật (con người).

Chuẩn bị lát cắt

Hầu hết các mô tươi rất mỏng, dễ bị biến dạng và hư hỏng. Vì vậy, không thể chuẩn bị các lát mỏng trừ khi nó được đặt bằng cách nào đó trong khi cắt. Thông thường, mẫu vật cũng cần được bảo quản hoặc “cố định” trước khi chuẩn bị các phần cắt. Có 2 cách:

• Mô có thể được làm lạnh nhanh chóng và giữ lạnh trong khi cắt bằng máy cắt lạnh vi phẫu mô tế bào (microtome). Chúng được gọi là “phần đông lạnh”. Các phần đông lạnh có thể được chuẩn bị rất nhanh và do đó được sử dụng khi cần chẩn đoán trong khi phẫu thuật để hướng dẫn quy trình phẫu thuật hoặc khi cần tránh bất kỳ loại can thiệp nào vào thành phần hóa học của tế bào (như trong một số nghiên cứu mô hóa học).
• Ngoài ra, có thể nhúng vào mẫu một chất lỏng mà sau đó có thể chuyển thành chất rắn có các đặc tính vật lý thích hợp cho phép cắt thành lát mỏng. Nhiều tác nhân khác nhau có thể được sử dụng để thấm và hỗ trợ mẫu vật, bao gồm nhựa epoxy và methacrylate, nhưng sáp mô học dựa trên sáp parafin là loại phổ biến nhất cho kính hiển vi ánh sáng thông thường. Điều này tạo ra cái gọi là “phần paraffin”. Những phần này thường được chuẩn bị bằng Máy cắt lát tiêu bản quay. “Rotary” mô tả hoạt động cắt của dụng cụ. Trong tất cả các phòng thí nghiệm mô bệnh học, các phần parafin được chuẩn bị thường xuyên từ hầu hết các mẫu bệnh phẩm và được sử dụng trong chẩn đoán.

Nội dung dưới đây mô tả các bước chính trong việc chuẩn bị các phần paraffin. Các bước này thường quy định cách bố trí và quy trình làm việc trong các phòng thí nghiệm mô bệnh học chuyên biệt, lớn, nơi hàng trăm mẫu được xử lý mỗi ngày.

Tiếp nhận mẫu mô

Mẫu vật nhận được để kiểm tra mô học có thể đến từ một số nguồn khác nhau. Chúng bao gồm từ những mẫu vật rất lớn hoặc toàn bộ cơ quan đến những mảnh mô nhỏ. Ví dụ: sau đây là một số loại mẫu bệnh phẩm thường được nhận trong phòng thí nghiệm mô bệnh học.

• Mẫu vật cắt bỏ (sinh thiết phẫu thuật), trong đó toàn bộ cơ quan hoặc vùng bị ảnh hưởng được cắt bỏ khi phẫu thuật
• Mẫu sinh thiết mẫu 1 phần, trong đó mô được lấy ra để chẩn đoán từ bên trong vùng bị ảnh hưởng
• Sinh thiết bấm, sử dụng dụng cụ chuyên dụng để lấy ra một mảnh mô nhỏ để kiểm tra (thường là từ da)
• Sinh thiết cạo, trong đó các mảnh mô nhỏ được “cạo” khỏi bề mặt (thường là da)
• Nạo, trong đó mô được lấy ra thành từng mảnh nhỏ từ niêm mạc tử cung hoặc cổ tử cung
• Sinh thiết lõi, trong đó một mẫu mô nhỏ được lấy ra bằng kim đặc biệt

Mẫu thường được nhận ở dạng cố định (chất bảo quản) nhưng đôi khi được gửi đến ở dạng tươi và phải được cố định ngay lập tức. Trước khi các mẫu được chấp nhận bởi phòng thí nghiệm, việc ghi nhãn và tài liệu đi kèm sẽ được kiểm tra cẩn thận, tất cả các chi tiết được ghi lại và bắt đầu “theo dõi mẫu”. Điều quan trọng là bệnh nhân hoặc mẫu nghiên cứu phải được xác định chính xác và nguy cơ thiếu chính xác được giảm thiểu.

Cố định mô

Cố định mô là một bước quan trọng trong việc chuẩn bị mẫu vật để kiểm tra bằng kính hiển vi. Mục tiêu của nó là ngăn ngừa sự phân hủy và bảo tồn các tế bào và mô ở trạng thái “life-like”. Nó thực hiện điều này bằng cách ngừng hoạt động của enzyme, tiêu diệt vi sinh vật và làm cứng mẫu vật trong khi vẫn duy trì đủ cấu trúc phân tử để cho phép áp dụng các phương pháp nhuộm thích hợp (bao gồm các phương pháp liên quan đến phản ứng kháng nguyên-kháng thể và các phương pháp phụ thuộc vào việc bảo quản DNA và RNA). Việc cố định càng sớm được bắt đầu sau khi tách mẫu khỏi nguồn cung cấp máu của nó thì kết quả sẽ càng tốt. Chất cố định phổ biến nhất là formaldehyde, thường ở dạng dung dịch đệm photphat (thường được gọi là “formalin”). Lý tưởng nhất là mẫu vật phải được cố định bằng cách nhúng trong formalin từ 6-12 giờ trước khi chúng được xử lý.

Phẫu tích

Phẫu tích mô, thường được gọi là “cắt nhỏ”, bao gồm việc kiểm tra và mô tả cẩn thận mẫu vật, bao gồm hình thức bên ngoài, số lượng mảnh và kích thước của chúng. Các mẫu vật lớn hơn có thể yêu cầu mổ xẻ thêm để tạo ra các mảnh mô từ các khu vực thích hợp. Ví dụ, lấy nhiều mẫu từ phần cắt bỏ của khối u để đảm bảo rằng khối u đã được loại bỏ hoàn toàn. Trong trường hợp mẫu nhỏ, toàn bộ mẫu có thể được xử lý. Các mô được chọn để xử lý sẽ được đặt trong cassettes và các lô sẽ được nạp vào máy xử lý mô để xử lý thành sáp.

Xử lý mô

Khi các lô mẫu lớn được xử lý để chuẩn bị phần parafin, các thiết bị xử lý mô tự động sẽ được sử dụng. Những thiết bị này cho phép mẫu được ngấm vào các dung môi khác nhau và hoàn thiện bằng sáp parafin nóng chảy. Các mẫu thử bắt đầu ở trong môi trường nước (gốc nước) và phải trải qua nhiều lần thay đổi dung môi khử nước và làm sạch (thường là ethanol và xylene) trước khi chúng có thể được đặt trong sáp nóng chảy (kỵ nước và không thể trộn lẫn với nước).