Ly tâm là một công cụ mạnh mẽ cho quy trình công việc để cô lập và xác định đặc tính của các sản phẩm protein. Sự tập hợp protein là một hiện tượng sinh học gây ra bởi sự tương tác bất thường của các protein bị mất ổn định. Đặc tính hoạt động của protein trong dung dịch là rất quan trọng, vì các protein không ổn định dễ bị thay đổi về mặt hóa học và vật lý dẫn đến mất chức năng. Quan trọng nhất, trong quá trình phát triển thuốc dựa trên protein, ngay cả lượng tập hợp tối thiểu cũng có thể gây ra tác động có hại do thay đổi tiềm năng về hiệu lực của dược phẩm sinh học và phản ứng miễn dịch bất lợi ở bệnh nhân. Ngoài ra, số lượng thuốc sinh học tương tự ngày càng tăng đòi hỏi các quy trình quản lý nghiêm ngặt nhằm giải quyết hợp lý việc phân tích chất lượng sản phẩm của các công ty dược phẩm sinh học.

Nhiều yếu tố có thể ảnh hưởng đến hoạt động và sự kết tụ của protein, bao gồm nhiệt độ, quá trình oxy hóa, nồng độ, pH, cường độ ion, chất phụ gia, chất tẩy rửa, chất bảo quản lạnh, chu trình đông lạnh, rã đông, điều kiện bảo quản và xử lý.

Danh mục máy ly tâm Beckman Coulter mang đến khả năng phân tách chất lượng và phân tích protein tiên tiến, mang đến cho người dùng các giải pháp toàn diện cho cả quy trình. Giải pháp quy trình làm việc dựa trên ly tâm có thể có hiệu quả cao vì nó giải quyết một cách hệ thống nhu cầu phân tách bằng cách sử dụng độ dốc lực g và mật độ tăng dần để tách các hạt dựa trên khối lượng và mật độ.

Một chuỗi polypeptide chưa được gập lại sẽ tạo thành cấu trúc protein ba chiều được gập lại đúng cách. Ngược lại, nếu các tương tác chính không được hình thành, protein không ổn định có thể tổng hợp và tạo thành các khối protein độc hại.

Ly tâm hỗn hợp protein thô – Bước bắt buộc trong nghiên cứu tinh chế và tổng hợp protein

Khởi đầu của nghiên cứu về sự tổng hợp protein là quá trình tinh chế protein. Thông thường, protein được biểu hiện quá mức trong cơ thể sinh vật, như vi khuẩn, nấm men hoặc tế bào động vật có vú trong môi trường nuôi cấy. Các đặc điểm riêng của mỗi protein, chẳng hạn như thành phần axit amin, kích thước, hình dạng, điểm đẳng điện và độ hòa tan được sử dụng để phát triển các chiến lược riêng biệt để phân lập protein quan tâm. Mục tiêu là cô lập lượng protein chức năng quan tâm lớn nhất với lượng chất gây ô nhiễm khác ít nhất. Ly tâm là bước quan trọng và thường là bước đầu tiên trong bất kỳ quy trình tinh chế protein nào. Dòng máy ly tâm tốc độ cao Avanti JXN có sẵn một loạt rôto để hỗ trợ bất kỳ giai đoạn tinh chế protein nào. Nhiều sự lựa chọn rotor – với sự kết hợp khác nhau về âm lượng và lực g – làm cho JXN trở thành một thiết bị linh hoạt có khả năng đáp ứng nhu cầu của một loạt các dự án proteomic và có thể tuân theo các bộ đệm khác nhau để thúc đẩy sự ổn định của protein. Tinh chế protein ly tâm với dòng Avanti JXN hiệu suất cao rất mạnh mẽ và cung cấp cho người dùng kỹ thuật có khả năng tái sản xuất cao.

Siêu ly tâm – Bước mạnh mẽ để tách protein khỏi các khối dựa trên kích thước

Người ta đã chứng minh rõ ràng rằng ly tâm là một phương pháp mạnh mẽ và có thể áp dụng rộng rãi để tách hỗn hợp thô của các thành phần tế bào. Hơn nữa, siêu ly tâm kết hợp với gradient mật độ là một kỹ thuật chính để tách và phân tích các protein quan tâm dựa trên kích thước và khối lượng. Trong quá trình quay ly tâm dưới một lực hấp dẫn cụ thể, các phân tử di chuyển từ trên xuống dưới cùng của dung dịch trong ống. Chuyển động này được bù đắp bởi mật độ và độ nhớt của chất lỏng hoặc lực nổi. Ở trạng thái cân bằng, tác động ròng của lực hấp dẫn và lực nổi sẽ dẫn đến sự tích tụ các protein cụ thể tại một điểm cụ thể trong ống, từ đó tách protein ra khỏi các tập hợp có hệ số lắng khác nhau. Các protein tổng hợp đặc hơn di chuyển ra ngoài nhanh hơn các phân tử protein riêng lẻ nhẹ hơn.

Độ dốc mật độ vùng tỷ lệ liên tục được hình thành bằng cách xếp lớp độ dốc bước đầu tiên. Trong kỹ thuật phổ biến nhất, trước tiên một lượng dung dịch ít đậm đặc hơn được bơm vào ống ly tâm và các dung dịch đậm đặc hơn lần lượt được đưa vào đáy ống bằng cách sử dụng một ống tiêm dài để không làm ảnh hưởng đến lớp trước đó, để lại một ranh giới rõ ràng giữa các lớp mật độ khác nhau. Một cách tiếp cận khác là xếp lớp các giải pháp đậm đặc giảm dần một cách nhẹ nhàng lên trên các giải pháp đậm đặc hơn. Một gradient liên tục cũng có thể được tạo ra từ một gradient không liên tục bằng cách ủ hoặc quay dung dịch trong một khoảng thời gian định trước hoặc bằng cách sử dụng máy tạo gradient. Phương pháp thứ ba, gradient mật độ nổi, bao gồm quá trình ly tâm tốc độ cao kéo dài của một phân tử ở mật độ dung dịch tương tự, dẫn đến sự phân tách phân tử nghiêm ngặt.

Trong tất cả các kỹ thuật này, dung dịch khuếch tán sao cho mật độ tăng dần từ đỉnh xuống đáy ống.

Sau khi hình thành gradient, một thể tích nhỏ dung dịch chứa hỗn hợp protein được đặt lên trên gradient mật độ. Hầu như luôn luôn, khi rôto quay, các protein di chuyển theo gradient và phân tách theo hệ số lắng của chúng, với các tập hợp protein lắng nhanh hơn một sản phẩm protein riêng lẻ được quan tâm. Thời gian và tốc độ ly tâm được xác định theo kinh nghiệm.

Sau khi ly tâm, các protein tách biệt thường được thu hoạch bằng cách làm thủng một lỗ ở đáy ống và thu từng giọt các phần phân đoạn, hoặc bằng cách dùng pipet lấy các phần phân đoạn từ mặt khum theo cách thủ công. Các xét nghiệm sinh hóa hoặc chức năng có thể được thực hiện để đánh giá hàm lượng protein của từng phần.

Ngoài việc tách tập hợp protein, việc tinh chế phức hợp protein-phối tử thường được sử dụng trong nghiên cứu các liệu pháp điều trị dựa trên protein. Dòng máy siêu ly tâm Optima XPN bao gồm các máy ly tâm chuẩn bị tương thích với một loạt rôto và vật tư tiêu hao phù hợp với nhiều giao thức khác nhau trong quy trình tinh chế protein.

Một kỹ thuật thường được sử dụng để tách protein là sắc ký loại trừ kích thước (SEC). Khi so sánh với quá trình ly tâm, SEC yêu cầu hệ số pha loãng lớn, tính không tương thích của protein và các tương tác không mong muốn giữa protein và nhựa (hiệu ứng matrix) cũng như độ phân giải thấp. Ly tâm gradient mật độ là thuận lợi vì nó cho phép người dùng điều chỉnh các thông số để phân tách hiệu quả tuân theo các định luật nhiệt động lực học, có thể sửa đổi đối với tất cả các protein sau khi tối ưu hóa thời gian quay, tốc độ và điều kiện gradient.

Sự tiếp xúc oxy hóa của protein ở bề mặt chất lỏng không khí cũng có thể dẫn đến sự gia tăng kết tụ. Cần có lượng lớn chất khử trong dung dịch đệm để tách SEC, điều này có thể làm tăng thêm chi phí cho thí nghiệm. Hơn nữa, dung dịch đệm điển hình được bảo quản trong các chai chứa dung tích lớn, với diện tích bề mặt không khí-lỏng ngày càng tăng. Việc bịt kín các ống Opti-Seal và Quick-Seal tương thích với máy siêu ly tâm Beckman Coulter giúp giảm thiểu bề mặt tiếp xúc không khí-lỏng, dẫn đến sản phẩm protein ổn định hơn và giảm sự kết tụ. Hơn nữa, quá trình ly tâm giúp loại bỏ nhu cầu sử dụng thẻ nhiệt hạch, nhược điểm phổ biến của các kỹ thuật tinh chế protein dựa trên sắc ký, có thể ảnh hưởng đáng kể đến khả năng hòa tan protein.

Siêu ly tâm phân tích – Một công cụ mạnh mẽ để phân tích protein từ các tập hợp

Như đã thảo luận ở trên, SEC là một công cụ phân tách có những sai sót lớn, bao gồm các hiệu ứng pha loãng và matrix đáng kể. Do đó, phương pháp này không lý tưởng cho việc đánh giá quan trọng về kích thước hạt và sự kết tụ của các sản phẩm dựa trên protein. Hơn nữa, nó dựa vào các tiêu chuẩn để đánh giá trọng lượng phân tử, đưa ra một biến bổ sung làm tăng biên độ sai sót và khả năng không đáng tin cậy của phương pháp SEC.

Ngược lại, Siêu ly tâm phân tích (AUC) cung cấp cho người dùng nhiều câu trả lời hơn bất kỳ kỹ thuật tương đương nào. AUC là thiết bị chính xác và mạnh mẽ nhất để định lượng sự tổng hợp protein. Đây là một phương pháp tuyệt đối dựa trên mô hình vật lý nguyên lý đầu tiên để xác định hình dạng phân tử, trọng lượng và sự hình thành phức tạp ở độ phân giải cao bằng cách sử dụng nhiều cỡ mẫu và nồng độ không pha loãng. Hơn nữa, sự tương tác bề mặt tối thiểu không có tiêu chuẩn và không có ma trận mang đến cho người dùng khả năng sử dụng nhiều thành phần đệm có thể có.

Trong nghiên cứu các sản phẩm protein và sự kết tụ, thành phần đệm (pH, cường độ ion, chất phụ gia, v.v.) là quan trọng nhất vì nó ảnh hưởng trực tiếp đến sự ổn định của protein. AUC hỗ trợ việc lựa chọn ứng cử viên thuốc chì, phát triển công thức sinh học trị liệu, mô tả đặc tính sản phẩm và đánh giá độ ổn định. Việc sử dụng AUC trong phân tích chất lượng sản phẩm của các công ty dược phẩm sinh học có thể giúp xác định hiệu quả phản ứng miễn dịch bất lợi có thể có của thuốc dựa trên protein hoặc thuốc sinh học tương tự. Optima AUC mới mở rộng phạm vi giải pháp do AUC cung cấp và cung cấp cho người dùng các thông số lắng đọng phân tử và đặc tính tổng hợp được xác định rõ ràng.

Nguồn:

Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các thiết bị ly tâm hãng Beckman Coulter.