Giới thiệu về hệ thống chụp ảnh trên kính hiển vi kỹ thuật số
Trong hầu hết thế kỷ 20, nhũ tương hóa học cảm quang trên phim chụp được sử dụng để tái tạo hình ảnh từ kính hiển vi quang học. Chỉ trong thập kỷ qua, những cải tiến trong máy ảnh điện tử và công nghệ máy tính đã làm cho việc sử dụng hình ảnh kỹ thuật số nhanh hơn, rẻ hơn và chính xác hơn nhiều so với chụp ảnh thông thường. Sau đó, một loạt các kỹ thuật mới và thú vị đã được phát triển cho phép các nhà nghiên cứu thăm dò sâu hơn vào các mô, quan sát các quá trình sinh học cực kỳ nhanh chóng trong tế bào sống và thu được thông tin định lượng về các sự kiện không gian và thời gian ở cấp độ tiếp cận với phân tử đơn lẻ. Thiết bị chụp ảnh là một trong những thành phần quan trọng nhất trong kính hiển vi quang học vì nó xác định mức độ chi tiết mẫu vật có thể được phát hiện, các cấu trúc liên quan được giải quyết và/hoặc động lực học của một quá trình được hiển thị và ghi lại. Phạm vi của các phương pháp phát hiện ánh sáng và sự đa dạng của các thiết bị hình ảnh hiện có đối với người sử dụng kính hiển vi làm cho quá trình lựa chọn thiết bị trở nên khó khăn và thường gây nhầm lẫn. Cuộc thảo luận này nhằm mục đích hỗ trợ hiểu biết cơ bản về phát hiện ánh sáng, các đặc tính cơ bản của hình ảnh kỹ thuật số và các tiêu chí liên quan đến việc lựa chọn máy dò phù hợp cho các ứng dụng cụ thể.
Việc ghi hình ảnh bằng kính hiển vi đã có từ lâu. Thấu kính đơn đầu tiên do các nhà khoa học Hà Lan Antoni van Leeuwenhoek và Jan Swammerdam phát triển vào cuối những năm 1600, đã được các nhà nghiên cứu tiên phong này sử dụng để tạo ra các bản vẽ rất chi tiết về máu, vi sinh vật và các mẫu vật nhỏ khác. Nhà khoa học người Anh Robert Hooke đã chế tạo một trong những chiếc kính hiển vi phức hợp đầu tiên và sử dụng nó để viết Micrographia, cuốn sách nổi bật của ông về kính hiển vi và hình ảnh được xuất bản năm 1665. Các kính hiển vi được phát triển trong thời kỳ này không có khả năng chiếu hình ảnh và việc quan sát chỉ giới hạn ở việc quan sát kỹ các mẫu vật qua thị kính. Những hình ảnh chân thực lần đầu tiên thu được bằng kính hiển vi vào năm 1835 khi William Henry Fox Talbot áp dụng quy trình nhũ tương hóa học để chụp ảnh vi mô ở độ phóng đại thấp. Giữa những năm 1830 và 1840 đã có sự phát triển mạnh mẽ trong việc ứng dụng nhũ tương để ghi lại những hình ảnh hiển vi. Trong 150 năm tiếp theo, nghệ thuật và khoa học chụp ảnh qua kính hiển vi bằng nhũ tương ảnh đã cùng phát triển với những tiến bộ trong công nghệ phim ảnh. Vào cuối những năm 1800 và đầu những năm 1900, Carl Zeiss và Ernst Abbe đã hoàn thiện việc sản xuất kính quang học chuyên dụng và áp dụng công nghệ mới vào nhiều dụng cụ quang học, bao gồm cả kính hiển vi phức hợp.
Hình ảnh động của hoạt động sinh học được giới thiệu vào năm 1909 bởi nghiên cứu sinh tiến sĩ người Pháp Jean Comandon, người đã trình bày một trong những video tua nhanh thời gian sớm nhất về bệnh giang mai sản sinh xoắn khuẩn. Kỹ thuật của Comandon cho phép sản xuất phim về thế giới vi mô. Giữa những năm 1970 và 1980, các nhà nghiên cứu đã kết hợp máy quay video dạng ống với kính hiển vi để tạo ra chuỗi hình ảnh tua nhanh thời gian và video thời gian thực. Vào những năm 1990, máy ảnh ống đã nhường chỗ cho công nghệ trạng thái rắn và thiết bị ghép điện tích mảng diện tích (CCD), báo trước một kỷ nguyên mới trong kỹ thuật chụp ảnh vi mô. Thuật ngữ hiện tại đề cập đến việc chụp ảnh điện tử bằng kính hiển vi là hình ảnh kỹ thuật số hoặc điện tử .
Thu nhận hình ảnh kỹ thuật số: Chuyển đổi tương tự sang kỹ thuật số
Bất kể ánh sáng tập trung vào mẫu vật cuối cùng có tác động đến võng mạc của con người, nhũ tương phim, màn hình huỳnh quang hay mảng photodiode của CCD hay không, hình ảnh tương tự vẫn được tạo ra. Những hình ảnh này có thể chứa nhiều cường độ và màu sắc khác nhau. Hình ảnh thuộc loại này được gọi là tông màu liên tục vì các sắc thái và màu sắc khác nhau hòa trộn với nhau mà không bị gián đoạn, tạo ra sự tái tạo hạn chế nhiễu xạ của mẫu ban đầu. Hình ảnh có tông màu liên tục ghi lại dữ liệu hình ảnh một cách chính xác bằng cách sử dụng chuỗi dao động tín hiệu điện thay đổi liên tục trong toàn bộ hình ảnh.
Khi chúng ta xem chúng, hình ảnh thường có kích thước hình vuông hoặc hình chữ nhật, do đó mỗi pixel được biểu thị bằng một cặp tọa độ với các giá trị x và y cụ thể , được sắp xếp theo hệ tọa độ Descartes điển hình (Hình 1c). Tọa độ x chỉ định vị trí ngang hoặc vị trí cột của pixel, trong khi tọa độ y biểu thị số hàng hoặc vị trí dọc. Do đó, một hình ảnh kỹ thuật số bao gồm một mảng pixel hình chữ nhật hoặc hình vuông biểu thị một loạt các giá trị cường độ được sắp xếp theo hệ tọa độ ( x , y ). Trong thực tế, hình ảnh chỉ tồn tại dưới dạng một mảng lớn các giá trị dữ liệu nối tiếp mà máy tính có thể diễn giải để tạo ra biểu diễn kỹ thuật số của cảnh gốc.
Tỷ lệ kích thước ngang và dọc của hình ảnh kỹ thuật số được gọi là tỷ lệ khung hình và có thể được tính bằng cách chia chiều rộng của hình ảnh cho chiều cao. Tỷ lệ khung hình xác định hình dạng của hình ảnh. Bằng cách tuân thủ tỷ lệ khung hình tiêu chuẩn để hiển thị hình ảnh kỹ thuật số, hình ảnh sẽ tránh được hiện tượng biến dạng tổng thể khi hình ảnh được hiển thị trên nền tảng từ xa. Khi một hình ảnh tông màu liên tục được lấy mẫu và lượng tử hóa, kích thước pixel của hình ảnh kỹ thuật số thu được sẽ có tỷ lệ khung hình của hình ảnh tương tự gốc. Điều quan trọng là mỗi pixel có tỷ lệ khung hình 1:1 (pixel vuông) để đảm bảo khả năng tương thích với các thuật toán xử lý hình ảnh kỹ thuật số phổ biến và để giảm thiểu biến dạng.
Độ phân giải không gian trong hình ảnh kỹ thuật số
Chất lượng của hình ảnh kỹ thuật số hoặc độ phân giải hình ảnh được xác định bởi tổng số pixel và phạm vi giá trị độ sáng có sẵn cho mỗi pixel. Độ phân giải hình ảnh là thước đo mức độ mà hình ảnh kỹ thuật số thể hiện các chi tiết đẹp của hình ảnh tương tự được ghi lại bằng kính hiển vi. Thuật ngữ độ phân giải không gian được dành riêng để mô tả số lượng pixel được sử dụng trong việc xây dựng và hiển thị hình ảnh kỹ thuật số. Số lượng này phụ thuộc vào độ mịn của hình ảnh được lấy mẫu trong quá trình số hóa, với hình ảnh có độ phân giải không gian cao hơn có số lượng pixel lớn hơn trong cùng kích thước hình ảnh vật lý. Do đó, khi số lượng pixel thu được trong quá trình lấy mẫu và lượng tử hóa hình ảnh kỹ thuật số tăng lên thì độ phân giải không gian của hình ảnh cũng tăng lên.
Tần số lấy mẫu tối ưu hoặc số pixel được sử dụng để tạo hình ảnh kỹ thuật số được xác định bằng cách kết hợp độ phân giải của thiết bị hình ảnh và hệ thống máy tính được sử dụng để hiển thị hình ảnh. Phải tạo đủ số lượng pixel bằng cách lấy mẫu và lượng tử hóa để thể hiện hình ảnh gốc một cách đáng tin cậy. Khi hình ảnh tương tự được lấy mẫu không đầy đủ, một lượng chi tiết đáng kể có thể bị mất hoặc bị che khuất, như được minh họa bằng sơ đồ trong Hình 2. Tín hiệu tương tự được trình bày trong Hình 2(a) hiển thị phân bố cường độ liên tục được hiển thị bởi hình ảnh gốc, trước khi lấy mẫu và số hóa, khi được vẽ như một hàm của vị trí mẫu. Khi thu được 32 mẫu kỹ thuật số (Hình 2(b)), hình ảnh thu được giữ lại phần lớn cường độ đặc trưng và tần số không gian có trong hình ảnh tương tự ban đầu.
Khi tần số lấy mẫu giảm như trong Hình 2(c) và (d), các tần số có trong ảnh gốc sẽ bị bỏ sót trong quá trình chuyển đổi tương tự sang số (A/D) và xuất hiện hiện tượng được gọi là răng cưa . Hình 2(d) minh họa hình ảnh kỹ thuật số có số lượng mẫu thấp nhất, trong đó việc khử răng cưa đã làm mất dữ liệu tần số không gian cao đồng thời đưa ra dữ liệu tần số giả thấp hơn không thực sự tồn tại.
Độ phân giải không gian của hình ảnh kỹ thuật số có liên quan đến mật độ không gian của hình ảnh tương tự và độ phân giải quang học của kính hiển vi hoặc thiết bị hình ảnh khác. Số lượng pixel và khoảng cách giữa các pixel (khoảng thời gian lấy mẫu) trong ảnh kỹ thuật số là hàm số về độ chính xác của thiết bị số hóa. Độ phân giải quang học là thước đo khả năng của hệ thống thấu kính quang học (kính hiển vi và máy ảnh) trong việc phân giải các chi tiết có trong cảnh gốc. Độ phân giải quang học bị ảnh hưởng bởi chất lượng quang học, cảm biến hình ảnh và thiết bị điện tử hỗ trợ. Mật độ không gian và độ phân giải quang học xác định độ phân giải không gian của hình ảnh. Độ phân giải không gian của hình ảnh chỉ bị giới hạn bởi mật độ không gian khi độ phân giải quang học của hệ thống hình ảnh cao hơn mật độ không gian.
Tất cả các chi tiết có trong hình ảnh kỹ thuật số đều bao gồm các chuyển đổi độ sáng xoay vòng giữa các mức độ sáng và tối khác nhau. Tốc độ chu kỳ giữa các lần chuyển đổi độ sáng được gọi là tần số không gian của hình ảnh, với tốc độ cao hơn tương ứng với tần số không gian cao hơn. Mức độ sáng khác nhau trong các mẫu vật nhỏ được quan sát qua kính hiển vi là phổ biến, với nền thường bao gồm cường độ đồng đều và mẫu vật thể hiện phạm vi mức độ sáng lớn hơn.
Giá trị bằng số của mỗi pixel trong ảnh kỹ thuật số biểu thị cường độ trung bình của ảnh quang học trong khoảng thời gian lấy mẫu. Do đó, cường độ nền sẽ bao gồm một hỗn hợp các pixel tương đối đồng đều, trong khi mẫu vật thường chứa các pixel có giá trị từ rất tối đến rất sáng. Các đặc điểm nhìn thấy trong kính hiển vi nhỏ hơn khoảng thời gian lấy mẫu kỹ thuật số sẽ không được thể hiện chính xác trong hình ảnh kỹ thuật số. Tiêu chí Nyquist yêu cầu khoảng thời gian lấy mẫu bằng hai lần tần số không gian cao nhất của mẫu để bảo toàn chính xác độ phân giải không gian trong hình ảnh kỹ thuật số thu được. Nếu việc lấy mẫu xảy ra ở khoảng thời gian dưới mức yêu cầu của tiêu chí Nyquist thì các chi tiết có tần số không gian cao sẽ không được thể hiện chính xác trong hình ảnh kỹ thuật số cuối cùng. Giới hạn độ phân giải Abbe đối với hình ảnh quang học là khoảng 0,22 micromet (sử dụng ánh sáng khả kiến), nghĩa là bộ số hóa phải có khả năng lấy mẫu ở các khoảng tương ứng trong không gian mẫu đến 0,11 micromet hoặc nhỏ hơn. Bộ số hóa lấy mẫu mẫu ở 512 pixel trên mỗi đường quét ngang sẽ phải tạo ra trường nhìn ngang tối đa là 56 micromet (512 x 0,11 micromet) để phù hợp với tiêu chí Nyquist. Khoảng 2,5 đến 3 mẫu cho đặc điểm có thể phân giải nhỏ nhất được đề xuất để đảm bảo lấy mẫu đầy đủ cho hình ảnh có độ phân giải cao.
Một hiện tượng lấy mẫu nghiêm trọng được gọi là răng cưa không gian (lấy mẫu dưới) xảy ra khi các chi tiết có trong hình ảnh tương tự hoặc mẫu thực tế được lấy mẫu ở tốc độ nhỏ hơn hai lần tần số không gian của chúng. Khi các pixel trong bộ số hóa được đặt cách nhau quá xa so với chi tiết tần số cao có trong ảnh, thông tin tần số cao nhất sẽ giả dạng các đặc điểm tần số không gian thấp không thực sự có trong ảnh kỹ thuật số. Hiện tượng răng cưa thường xảy ra dưới dạng chuyển đổi đột ngột khi tần số lấy mẫu giảm xuống dưới mức tới hạn, thấp hơn khoảng 25% so với giới hạn độ phân giải Nyquist. Các mẫu chứa các mẫu lặp đi lặp lại, cách đều nhau thường biểu hiện các viền moiré do các tạo tác răng cưa gây ra bằng cách lấy mẫu ở tần số nhỏ hơn 1,5 lần tần số mẫu lặp lại.
Chức năng chuyển đổi tương phản
Độ tương phản có thể được hiểu là thước đo sự thay đổi cường độ tín hiệu hình ảnh (ΔI) so với cường độ hình ảnh trung bình (I) được biểu thị bằng phương trình sau:
C = ΔI/I (1)
Điều cần cân nhắc chính là thực tế là một vật thể được chụp phải khác về cường độ được ghi lại so với nền của nó để có thể được cảm nhận. Độ tương phản và độ phân giải không gian có liên quan chặt chẽ với nhau và cả hai đều cần thiết để tạo ra hình ảnh chi tiết đại diện trong mẫu vật. Hàm truyền tương phản (CTF) tương tự như hàm truyền mô-đun (MTF), thước đo khả năng của kính hiển vi trong việc tái tạo độ tương phản của mẫu vật trong mặt phẳng hình ảnh trung gian ở một độ phân giải cụ thể. MTF là một hàm được sử dụng trong kỹ thuật điện để liên hệ lượng điều chế có trong tín hiệu đầu ra với tần số tín hiệu. Trong các hệ thống hình ảnh kỹ thuật số quang học, độ tương phản và tần số không gian có mối tương quan giữa điều chế đầu ra và tần số tín hiệu trong MTF. CTF mô tả khả năng truyền thông tin của hệ thống quang học bằng cách vẽ đồ thị phần trăm độ tương phản dưới dạng hàm của tần số không gian như trong Hình 3, minh họa CTF và phân bố sóng ánh sáng ở mặt phẳng tiêu cự phía sau vật kính. Khẩu độ phía sau vật kính được trình bày trong Hình 3(a) thể hiện sự nhiễu xạ của các bước sóng khác nhau tăng theo chu kỳ di chuyển từ tâm của khẩu độ ra ngoại vi, trong khi CTF trong Hình 3(b) biểu thị giới hạn Rayleigh của độ phân giải quang học.
Tần số không gian có thể được định nghĩa là số lần một tính năng định kỳ tái diễn trong một không gian hoặc khoảng đơn vị nhất định. Cường độ được ghi ở tần số không gian bằng 0 trong CTF là định lượng độ sáng trung bình của hình ảnh. Vì độ tương phản bị giới hạn nhiễu xạ nên tần số không gian gần 0 sẽ có độ tương phản cao (khoảng 100 phần trăm) và những tần số có tần số gần giới hạn nhiễu xạ sẽ có độ tương phản ghi được trong ảnh thấp hơn. Như biểu đồ CTF trong Hình 3 minh họa, Tiêu chí Rayleigh không phải là một giới hạn cố định mà đúng hơn là tần số không gian mà tại đó độ tương phản đã giảm xuống khoảng 25%. Do đó, CTF có thể cung cấp thông tin về mức độ hệ thống hình ảnh có thể thể hiện các đặc điểm nhỏ trong mẫu vật.
CTF có thể được xác định cho bất kỳ thành phần chức năng nào của hệ thống hình ảnh và là thước đo hiệu suất của toàn bộ hệ thống hình ảnh. Hiệu suất hệ thống được đánh giá là tích của các đường cong CTF được xác định cho từng thành phần. Do đó, nó sẽ thấp hơn so với bất kỳ thành phần riêng lẻ nào. Những đặc điểm nhỏ có độ tương phản hạn chế ngay từ đầu sẽ càng trở nên khó nhìn thấy hơn khi hình ảnh đi qua các thành phần kế tiếp của hệ thống. CTF thấp nhất thường được quan sát thấy trong vật kính và CCD. Tín hiệu tương tự do CCD tạo ra có thể được sửa đổi trước khi được chuyển đến bộ số hóa để tăng độ tương phản bằng cách sử dụng các điều khiển khuếch đại và bù tương tự. Khi hình ảnh đã được mã hóa kỹ thuật số, những thay đổi về độ phóng đại và điều chỉnh đồng thời hình học pixel có thể giúp cải thiện CTF tổng thể.
Độ sáng hình ảnh và độ sâu bit
Độ sáng của hình ảnh kỹ thuật số là thước đo các giá trị cường độ tương đối trên mảng pixel, sau khi hình ảnh được thu được bằng máy ảnh kỹ thuật số hoặc được số hóa bằng bộ chuyển đổi A/D. Không nên nhầm lẫn độ sáng với cường độ bức xạ, đề cập đến cường độ hoặc lượng năng lượng ánh sáng thực sự được phản xạ từ hoặc truyền qua vật thể được chụp ảnh. Liên quan đến xử lý hình ảnh kỹ thuật số, độ sáng được mô tả tốt nhất là cường độ đo được của tất cả các pixel tạo nên hình ảnh kỹ thuật số sau khi nó được chụp, số hóa và hiển thị. Độ sáng pixel rất quan trọng đối với việc xử lý hình ảnh kỹ thuật số vì ngoài màu sắc, nó là biến số duy nhất có thể được sử dụng bằng các kỹ thuật xử lý để điều chỉnh định lượng hình ảnh.
Bất kể phương pháp chụp nào, hình ảnh phải được số hóa để chuyển đổi cường độ tông màu liên tục của mẫu vật thành giá trị độ sáng kỹ thuật số. Độ chính xác của giá trị số tỷ lệ thuận với độ sâu bit của thiết bị số hóa. Nếu hai bit được sử dụng, hình ảnh chỉ có thể được biểu thị bằng bốn giá trị hoặc mức độ sáng (2 x 2). Tương tự, nếu ba hoặc bốn bit được xử lý, thì hình ảnh tương ứng có tám mức độ sáng (2 x 2 x 2) và 16 (2 x 2 x 2 x 2), như trong Hình 4, minh họa mối tương quan giữa độ sâu bit và số mức xám trong ảnh số. Nếu hai bit được sử dụng, hình ảnh chỉ có thể được biểu thị bằng bốn giá trị hoặc mức độ sáng. Tương tự, nếu ba hoặc bốn bit được xử lý, hình ảnh tương ứng có 8 và 16 mức độ sáng tương ứng. Trong tất cả các trường hợp này, cấp 0 đại diện cho màu đen, trong khi cấp cao nhất đại diện cho màu trắng và mỗi cấp độ trung gian là một màu xám khác nhau.
Thang độ xám hoặc phạm vi độ sáng của hình ảnh kỹ thuật số bao gồm các cấp độ sáng màu đen, trắng và xám. Độ sâu bit càng lớn thì càng có nhiều mức xám để thể hiện sự thay đổi cường độ trong hình ảnh. Ví dụ: bộ số hóa 12 bit có khả năng hiển thị 4.096 mức xám (2 x 10 12 ) khi được ghép nối với cảm biến có dải động 72 decibel (dB). Khi áp dụng theo nghĩa này, dải động đề cập đến mức tín hiệu tối đa liên quan đến nhiễu mà cảm biến CCD có thể truyền để hiển thị hình ảnh. Nó có thể được xác định dựa trên dung lượng tín hiệu pixel và đặc tính nhiễu của cảm biến. Thuật ngữ tương tự được sử dụng để mô tả phạm vi mức xám được sử dụng trong việc tạo và hiển thị hình ảnh kỹ thuật số. Cách sử dụng này có liên quan đến dải động của cảnh.
Thuật ngữ độ sâu bit đề cập đến phạm vi nhị phân của các giá trị thang độ xám có thể được sử dụng bởi bộ chuyển đổi tương tự sang kỹ thuật số, để chuyển thông tin hình ảnh tương tự thành các giá trị kỹ thuật số rời rạc có khả năng được đọc và phân tích bởi máy tính. Ví dụ: bộ chuyển đổi số hóa 8 bit phổ biến nhất có phạm vi nhị phân là 256 (2 x 10 8 ) giá trị có thể và bộ chuyển đổi 16 bit có 65.536 (2 x 10 16 ) giá trị có thể. Độ sâu bit của bộ chuyển đổi A/D xác định kích thước của mức tăng thang màu xám, với độ sâu bit cao hơn tương ứng với phạm vi thông tin hình ảnh hữu ích lớn hơn có sẵn từ máy ảnh.
Số lượng mức thang độ xám phải được tạo ra để đạt được chất lượng hình ảnh chấp nhận được phải đủ để mắt người không thể nhận thấy được các bước giữa các giá trị thang độ xám riêng lẻ. Sự khác biệt đáng chú ý duy nhất về cường độ của hình ảnh mức xám đối với mắt người bình thường là khoảng 2% trong điều kiện xem lý tưởng. Nhiều nhất, mắt người có thể phân biệt được khoảng 50 sắc thái xám riêng biệt trong phạm vi cường độ của màn hình video, cho thấy độ sâu bit tối thiểu của hình ảnh phải nằm trong khoảng từ 6 đến 7 bit.
Hình ảnh kỹ thuật số phải có độ phân giải ít nhất 8 bit đến 10 bit để tránh tạo ra các bước mức xám rõ ràng về mặt trực quan trong hình ảnh nâng cao khi độ tương phản tăng trong quá trình xử lý hình ảnh. Số lượng pixel và mức xám cần thiết để mô tả đầy đủ một hình ảnh được quyết định bởi các đặc tính vật lý của mẫu vật. Hình ảnh có độ tương phản cao, độ phân giải cao thường yêu cầu số lượng mức xám và pixel đáng kể để tạo ra kết quả khả quan, trong khi các hình ảnh có độ tương phản cao và độ phân giải thấp khác (chẳng hạn như cách tử đường) có thể được thể hiện đầy đủ với mật độ điểm ảnh và phạm vi mức xám thấp hơn đáng kể. Cuối cùng, có sự đánh đổi về hiệu suất máy tính giữa độ tương phản, độ phân giải, độ sâu bit và tốc độ của thuật toán xử lý hình ảnh.
Biểu đồ hình ảnh
Biểu đồ mức xám hoặc biểu đồ hình ảnh cung cấp nhiều thông tin hữu ích về cường độ hoặc độ sáng của hình ảnh kỹ thuật số. Trong biểu đồ điển hình, các pixel được định lượng cho từng mức xám của hình ảnh 8 bit. Trục hoành được chia tỷ lệ từ 0 đến 255 và số pixel đại diện cho mỗi mức xám được biểu thị trên trục tung. Thao tác thống kê dữ liệu biểu đồ cho phép so sánh hình ảnh về độ tương phản và cường độ của chúng. Số lượng pixel tương đối ở mỗi mức xám có thể được sử dụng để chỉ ra mức độ mà phạm vi mức xám đang được sử dụng bởi một hình ảnh kỹ thuật số. Cường độ điểm ảnh được phân bổ hợp lý giữa các mức xám trong ảnh có độ tương phản bình thường và biểu thị dải động lớn trong cảnh. Trong các hình ảnh có độ tương phản thấp, chỉ một phần nhỏ mức xám sẵn có được thể hiện và phạm vi động trong cảnh bị hạn chế. Khi cường độ pixel được phân bổ giữa các mức xám cao và thấp, khiến các mức trung gian không được phổ biến, sẽ có quá nhiều pixel đen trắng và độ tương phản thường cao.
Cảm biến máy ảnh CCD
Các quy trình cơ bản liên quan đến việc tạo ra hình ảnh bằng camera CCD bao gồm: cho các phần tử mảng photodiode tiếp xúc với ánh sáng tới, chuyển đổi các photon tích lũy thành electron, tổ chức điện tích thu được trong các giếng thế năng và cuối cùng là truyền các gói điện tích qua các thanh ghi dịch sang bộ khuếch đại đầu ra. Đầu ra điện tích từ các thanh ghi dịch chuyển được chuyển đổi thành điện áp và được khuếch đại trước khi số hóa trong bộ chuyển đổi A/D. Sự sắp xếp cấu trúc khác nhau của điốt quang và tụ quang dẫn đến nhiều kiến trúc CCD khác nhau. Một số cấu hình được sử dụng phổ biến hơn bao gồm các loại truyền khung (FT), khung hình đầy đủ (FF) và xen kẽ (IL). Những sửa đổi đối với kiến trúc cơ bản như nhân electron, làm mỏng/chiếu sáng mặt sau và sử dụng mảng vi thấu kính (thấu kính) đã giúp tăng độ nhạy và hiệu suất lượng tử của camera CCD. Cấu trúc cơ bản của một phần tử bán dẫn oxit kim loại (MOS) trong mảng CCD được minh họa trong Hình 5. Chất nền là tấm wafer silicon loại ap/n được cách điện bằng một lớp mỏng silicon dioxide (khoảng 100 nanomet) được áp dụng cho bề mặt của tấm wafer. Một mô hình lưới gồm các hình vuông polysilicon hoặc điện cực cổng dẫn điện, trong suốt về mặt quang học được sử dụng để điều khiển việc thu thập và truyền các quang điện tử qua các phần tử mảng.
Sau khi được tích lũy trong CCD trong khoảng thời gian phơi sáng, các quang điện tử sẽ tích lũy khi đặt điện áp dương (0-10 volt) vào điện cực. Điện áp đặt vào dẫn đến một vùng trống bên dưới điện cực được gọi là giếng thế. Số lượng electron có thể tích lũy trong giếng thế trước khi điện tích của chúng vượt quá điện trường ứng dụng được gọi là công suất giếng đầy đủ. Dung lượng giếng đầy đủ phụ thuộc vào kích thước pixel. Dung lượng giếng đầy đủ điển hình cho CCD được sử dụng trong kính hiển vi huỳnh quang là từ 20.000 đến 40.000 photon. Việc tiếp xúc quá nhiều với ánh sáng có thể dẫn đến độ bão hòa của các pixel, nơi các photon tràn vào các pixel lân cận và khiến hình ảnh bị mờ hoặc nhòe. Trong nhiều CCD hiện đại, các kênh “anti-blooming” đặc biệt được kết hợp để ngăn các electron dư thừa ảnh hưởng đến các pixel xung quanh. Lợi ích của việc anti-blooming thường lớn hơn việc giảm công suất giếng tối đa, vốn là tác dụng phụ của tính năng này.
Khoảng thời gian các electron được phép tích lũy trong giếng thế năng là thời gian tích phân xác định được điều khiển bởi một chương trình máy tính. Khi đặt điện áp vào cổng, các electron bị hút vào điện cực và di chuyển đến bề mặt phân cách oxit/silic, nơi chúng tích tụ trong vùng dày 10nm cho đến khi điện áp ở các điện cực được tuần hoàn hoặc theo đồng hồ. Các điện áp phân cực khác nhau áp dụng cho các điện cực cổng sẽ kiểm soát xem giếng điện thế hay rào chắn sẽ hình thành bên dưới một cổng cụ thể hay không. Trong quá trình truyền điện tích, gói điện tích được giữ trong giếng điện thế được chuyển từ pixel này sang pixel khác theo chu kỳ hoặc quy trình tính giờ thường được giải thích bằng cách tương tự với lữ đoàn xô như trong Hình 6. Trong sự tương tự của lữ đoàn xô, các hạt mưa trước tiên được thu thập song song mảng xô (Hình 6(a)), sau đó được truyền song song tới thanh ghi đầu ra nối tiếp (Hình 6(b)). Nước tích lũy trong thanh ghi nối tiếp sẽ được xuất ra, mỗi lần một thùng, đến nút đầu ra (thùng đo đã hiệu chuẩn). Tùy thuộc vào loại CCD, có thể sử dụng các cấu hình mạch xung nhịp khác nhau. Sơ đồ đồng hồ ba pha thường được sử dụng trong các máy ảnh khoa học.
Lưới điện cực tạo thành một thanh ghi song song hai chiều. Khi một chuỗi điện áp thay đổi được lập trình được áp vào các điện cực cổng, các electron có thể được dịch chuyển qua mảng song song. Mỗi hàng trong thanh ghi song song được chuyển tuần tự vào thanh ghi nối tiếp. Nội dung của thanh ghi nối tiếp được dịch chuyển từng pixel một vào bộ khuếch đại đầu ra, nơi tạo ra tín hiệu tỷ lệ với mỗi gói sạc. Khi thanh ghi nối tiếp bị xóa, hàng tiếp theo trong thanh ghi song song sẽ được dịch chuyển và quá trình này tiếp tục cho đến khi thanh ghi song song được làm trống. Chức năng này của CCD được gọi là truyền điện tích hoặc đọc và dựa vào việc truyền điện tích hiệu quả từ điốt quang tới bộ khuếch đại đầu ra. Tốc độ truyền dữ liệu hình ảnh phụ thuộc vào cả băng thông của bộ khuếch đại đầu ra và tốc độ của bộ chuyển đổi A/D.
Cảm biến máy ảnh CCD sử dụng nhiều kiến trúc khác nhau để hoàn thành nhiệm vụ thu thập photon và di chuyển điện tích ra khỏi thanh ghi và vào bộ khuếch đại đọc. Kiến trúc CCD đơn giản nhất được gọi là Full Frame (FF) (xem Hình 7a). Cấu hình này bao gồm một thanh ghi dịch chuyển photodiode song song và một thanh ghi dịch chuyển nối tiếp. CCD khung hình đầy đủ sử dụng toàn bộ mảng pixel để phát hiện đồng thời các photon tới trong thời gian phơi sáng và do đó có hệ số lấp đầy 100%. Mỗi hàng trong thanh ghi song song được chuyển vào thanh ghi nối tiếp. Các pixel trong thanh ghi nối tiếp được đọc thành các gói riêng biệt cho đến khi tất cả thông tin trong mảng được chuyển vào bộ khuếch đại đọc. Bộ khuếch đại đầu ra sau đó tạo ra tín hiệu tỷ lệ với tín hiệu của từng pixel trong mảng. Vì mảng song song được sử dụng để phát hiện các photon và truyền dữ liệu điện tử nên phải sử dụng màn trập cơ học hoặc ánh sáng nhấp nháy đồng bộ để ngăn các điốt quang chiếu sáng liên tục. CCD khung hình đầy đủ thường tạo ra hình ảnh có độ phân giải cao, mật độ cao nhưng có thể bị nhiễu khi đọc đáng kể.
Hệ thống chuyển đổi vùng (FT) (Hình 7b) chia mảng thành vùng quang hoạt và mảng được che chắn hoặc che chắn ánh sáng, trong đó dữ liệu điện tử được lưu trữ và chuyển đến thanh ghi nối tiếp. Việc chuyển từ vùng hoạt động sang mảng lưu trữ tùy thuộc vào kích thước mảng nhưng có thể mất chưa đến nửa mili giây. Dữ liệu được chụp trong vùng hình ảnh hoạt động sẽ được chuyển nhanh chóng đến thanh ghi lưu trữ nơi chúng được đọc ra từng hàng vào thanh ghi nối tiếp. Sự sắp xếp này cho phép đọc đồng thời khung hình ban đầu và tích hợp khung hình tiếp theo. Ưu điểm chính của chuyển đổi vùng là nó loại bỏ nhu cầu đóng cửa trong quá trình truyền điện tích và do đó làm tăng tốc độ khung hình của CCD.
Đối với mỗi hàng pixel hoạt động trong mảng Interline (IL) (Hình 7c) có một hàng chuyển khuất tương ứng. Vùng phơi sáng thu thập dữ liệu hình ảnh và sau khi tích hợp, mỗi pixel hoạt động sẽ nhanh chóng chuyển điện tích được thu thập sang phần bị khuất của pixel. Điều này cho phép máy ảnh thu được khung hình tiếp theo trong khi dữ liệu được chuyển sang các kênh truyền tải. Việc chia mảng thành các hàng pixel hoạt động và bị che xen kẽ cho phép tích hợp đồng thời điện thế và đọc dữ liệu hình ảnh. Sự sắp xếp này giúp loại bỏ sự cần thiết của màn trập bên ngoài và tăng tốc độ và tốc độ khung hình của thiết bị. Việc kết hợp một thấu kính cực nhỏ bù đắp một phần cho khả năng thu thập ánh sáng bị suy giảm do bị khuất pixel. Mỗi ống kính hướng một phần ánh sáng mà mặt nạ nhôm sẽ phản chiếu đến vùng hoạt động của pixel.
Tốc độ đọc có thể được nâng cao bằng cách xác định một hoặc nhiều mảng con đại diện cho các lĩnh vực quan tâm trong mẫu vật. Việc giảm số lượng pixel giúp đọc dữ liệu nhanh hơn. Lợi ích của việc tăng tốc độ đọc này xảy ra mà không làm tăng tiếng ồn tương ứng, không giống như trường hợp chỉ tăng tốc độ xung nhịp. Trong quy trình tính giờ được gọi là binning, điện tích được thu thập từ một nhóm pixel liền kề được chỉ định và tín hiệu kết hợp được chuyển vào thanh ghi nối tiếp. Kích thước của mảng tạo khối thường có thể lựa chọn và có thể nằm trong khoảng từ 2 x 2 pixel đến hầu hết mảng CCD. Lý do chính cho việc sử dụng tính năng tạo thùng là để cải thiện tỷ lệ nhiễu tín hiệu và dải động. Những lợi ích này phải trả giá bằng độ phân giải không gian. Do đó, việc tạo thùng thường được sử dụng trong các ứng dụng trong đó độ phân giải của hình ảnh ít quan trọng hơn tốc độ truyền tải nhanh và cải thiện tín hiệu.
Ngoài công nghệ ống kính vi mô, một số sửa đổi vật lý đã được thực hiện đối với CCD để cải thiện hiệu suất của máy ảnh. Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu sinh học hiện đại phải có khả năng phát hiện các tín hiệu yếu điển hình của nồng độ fluorophore thấp và thể tích mẫu vật nhỏ, đối phó với dòng photon kích thích thấp và đạt được tốc độ và độ nhạy cao cần thiết để chụp ảnh động học tế bào nhanh chóng. Nhu cầu đặt ra cho máy dò có thể rất đáng kể: giới hạn phát hiện cực thấp, thu thập dữ liệu nhanh và tạo ra tín hiệu có thể phân biệt được với tiếng ồn do thiết bị tạo ra.
Hầu hết các cải tiến CCD hiện đại là kết quả của việc khuếch đại điện tử. Điều này làm tránh làm mất đi các photon bị hấp thụ hoặc phản xạ từ các màng phủ trên các điểm ảnh trong CCD tiêu chuẩn. Ngoài ra, các electron được tạo ra trên bề mặt silicon bằng bước sóng cực tím và xanh lam thường bị mất do tái hợp ở bề mặt tiếp xúc silicon oxit, do đó khiến chip CCD truyền thống kém nhạy hơn với ánh sáng tới tần số cao. Sử dụng kỹ thuật khắc axit, tấm bán dẫn silicon CCD có thể được làm mỏng đồng đều đến khoảng 10-15 micromet. Ánh sáng tới được hướng vào mặt sau của thanh ghi song song cách xa cấu trúc cổng. Một điện thế tích tụ trên bề mặt và hướng điện tích được tạo ra vào các giếng điện thế. CCD được làm mỏng ở mặt sau thể hiện độ nhạy photon trong một phạm vi rộng của phổ điện từ, điển hình là từ bước sóng tia cực tím đến tia hồng ngoại gần. Làm mỏng mặt sau có thể được sử dụng với kiến trúc FF hoặc FT, kết hợp với các thiết bị nhân electron trạng thái rắn, để tăng hiệu suất lượng tử lên trên 90%.
CCD khuếch đại điện tử (EMCCD) là một biến thể của CCD thông thường trong đó một thanh ghi nhân điện tử được chèn vào giữa đầu ra thanh ghi nối tiếp và bộ khuếch đại điện tích. Thanh ghi khuếch đại này được thiết kế với một pha nối đất bổ sung để tạo ra vùng trường cao và điện áp cao hơn (35-45 volt) so với thanh ghi ngang CCD tiêu chuẩn (5-15 volt). Các electron đi qua vùng trường cao được nhân lên do xác suất xấp xỉ 1% rằng một electron sẽ được tạo ra do va chạm. Thanh ghi nhân bao gồm 4 cổng sử dụng mạch xung nhịp để tạo hiệu điện thế (35-40 volt) và tạo ra các electron thứ cấp bằng quá trình ion hóa va chạm . Sự ion hóa do va chạm xảy ra khi một hạt mang điện mất năng lượng trong quá trình tạo ra các hạt mang điện khác. Khi điều này xảy ra với sự có mặt của điện trường ứng dụng, quá trình đánh thủng do tuyết lở sẽ tạo ra một loạt các electron thứ cấp (độ lợi) trong thanh ghi. Mặc dù xác suất tạo ra electron thứ cấp là nhỏ (khoảng 1%) nhưng số lượng lớn pixel trong thanh ghi khuếch đại có thể dẫn đến việc tạo ra các electron có số lượng lên tới hàng trăm hoặc hàng nghìn.
CCD quét chậm truyền thống đạt được độ nhạy cao và tốc độ cao nhưng làm như vậy phải trả giá bằng tốc độ đọc. Tốc độ đọc bị hạn chế trong các máy ảnh này bởi bộ khuếch đại sạc. Để đạt được tốc độ cao, băng thông của bộ khuếch đại sạc phải càng rộng càng tốt. Tuy nhiên, khi băng thông tăng thì nhiễu của bộ khuếch đại cũng tăng theo. Băng thông thấp thường thấy của camera quét chậm có nghĩa là chúng chỉ có thể được đọc ở tốc độ thấp hơn (khoảng 1 MHz). EMCCD giải quyết hạn chế này bằng cách khuếch đại tín hiệu trước bộ khuếch đại điện tích, giảm nhiễu đọc tương đối xuống dưới một electron một cách hiệu quả, do đó cung cấp cả giới hạn phát hiện thấp và tốc độ cao. Do đó, EMCCD có thể tạo ra hình ảnh trong điều kiện ánh sáng yếu một cách nhanh chóng, có độ phân giải tốt, dải cường độ lớn và dải động rộng.
Các thước đo hiệu suất CCD: Độ nhạy của camera
Thuật ngữ độ nhạy liên quan đến hiệu suất của CCD có thể được hiểu khác nhau tùy thuộc vào mức ánh sáng tới được sử dụng trong một ứng dụng cụ thể. Trong các tình huống tạo ảnh trong đó mức tín hiệu thấp, chẳng hạn như trong kính hiển vi huỳnh quang, độ nhạy đề cập đến khả năng của CCD phát hiện các tín hiệu yếu. Trong các ứng dụng mức ánh sáng cao (chẳng hạn như chụp ảnh trường sáng của mẫu vật bị nhuộm màu), hiệu suất có thể được đo bằng khả năng xác định những thay đổi nhỏ trong hình ảnh sáng. Trong trường hợp mức ánh sáng yếu, nhiễu máy ảnh là yếu tố hạn chế độ nhạy nhưng trong trường hợp mức ánh sáng cao, nhiễu tín hiệu trở thành yếu tố hạn chế.
Tỉ số tín hiệu cực đại trên nhiễu (SNR) của máy ảnh có thể đo tỷ lệ mức tín hiệu mà máy ảnh có thể phát hiện trong một lần phơi sáng nhưng nó không thể xác định độ nhạy với ánh sáng yếu hoặc độ nhạy thay đổi trong tín hiệu lớn trừ khi các giá trị trong tỉ số đã biết. Một máy ảnh có 2 electron nhiễu camera và dung lượng giếng đầy 20.000 electron sẽ có cùng SNR (10.000: 1) như một máy ảnh có camera nhiễu 20 electron và công suất giếng đầy 200.000 electron. Tuy nhiên, camera đầu tiên sẽ nhạy hơn nhiều với tín hiệu thấp và camera thứ hai sẽ cung cấp độ nhạy tốt hơn nhiều đối với những thay đổi nhỏ trong tín hiệu lớn. Sự khác biệt nằm ở loại tiếng ồn cho từng ứng dụng. Máy ảnh trong điều kiện ánh sáng yếu bị hạn chế bởi nhiễu máy ảnh, trong trường hợp này là 2 electron, nghĩa là có thể phát hiện được tối thiểu khoảng 5 electron tín hiệu. Độ nhạy mức ánh sáng cao bị giới hạn bởi nhiễu của tín hiệu, trong trường hợp này là căn bậc hai của 200.000 (447 electron), biểu thị sự thay đổi có thể phát hiện được khoảng 0,2% tín hiệu.
Độ nhạy phụ thuộc vào hệ số nhiễu giới hạn và trong mọi tình huống, có một thước đo sơ bộ về hiệu suất của thiết bị CCD là tỷ lệ tín hiệu ánh sáng tới với tín hiệu nhiễu tổng hợp của máy ảnh. Tín hiệu (S) được xác định là tích của mức ánh sáng đầu vào (I), hiệu suất lượng tử (QE) và thời gian tích hợp ( T ) được tính bằng giây.
S = I × QE × T (2)
Có rất nhiều loại và nguồn nhiễu được tạo ra trong suốt quá trình tạo ảnh kỹ thuật số. Số lượng và tầm quan trọng của nó thường phụ thuộc vào ứng dụng và loại CCD được sử dụng để tạo ra hình ảnh. Các nguồn nhiễu chính được xem xét khi xác định tỷ lệ là nhiễu thống kê, nhiễu nhiệt (dòng tối) và nhiễu tiền khuếch đại, mặc dù các loại nhiễu khác có thể quan trọng trong một số ứng dụng và loại máy ảnh. Tổng nhiễu thường được tính bằng tổng nhiễu đọc ra, nhiễu dòng tối và nhiễu thống kê theo phương cầu phương như sau:
Tổng tiếng ồn = 
Tiếng ồn đọc 2 + Tiếng ồn tối 2 + Tiếng ồn bắn 2 (3)
Tiền khuếch đại hoặc nhiễu đọc được tạo ra bởi thiết bị điện tử đọc của CCD. Nhiễu đọc bao gồm hai loại hoặc nguồn nhiễu chính, liên quan đến hoạt động của các thành phần điện trạng thái rắn của CCD. Nhiễu trắng bắt nguồn từ bóng bán dẫn hiệu ứng trường bán dẫn oxit kim loại (MOSFET) của bộ khuếch đại đầu ra, trong đó điện trở MOSFET tạo ra nhiễu nhiệt. Nhiễu nhấp nháy hay còn gọi là nhiễu 1/f cũng là sản phẩm của bộ khuếch đại đầu ra bắt nguồn từ giao diện vật liệu giữa lớp silicon và silicon dioxide của các phần tử mảng.
Nhiễu nhiệt hoặc dòng điện tối cũng được tạo ra tương tự, do tạp chất trong silicon tạo ra trạng thái năng lượng trong khe hở dải silicon. Nhiễu nhiệt được tạo ra ở các trạng thái bề mặt, trong khối silicon và trong vùng cạn kiệt, mặc dù hầu hết được tạo ra ở trạng thái bề mặt. Dòng điện tối vốn có trong hoạt động của chất bán dẫn vì năng lượng nhiệt cho phép các electron trải qua quá trình chuyển đổi từng bước từ dải hóa trị sang dải dẫn, nơi chúng được thêm vào các electron tín hiệu và được đo bằng máy dò. Tiếng ồn nhiệt thường được giảm đi bằng cách làm mát CCD. Điều này có thể được thực hiện bằng cách sử dụng nitơ lỏng hoặc bộ làm mát nhiệt điện (Peltier). Phương pháp trước đây đặt CCD trong môi trường nitơ nơi nhiệt độ thấp đến mức loại bỏ được nhiễu nhiệt đáng kể. Làm mát bằng nhiệt điện thường được sử dụng để giảm sự góp phần của nhiễu nhiệt vào tổng nhiễu của máy ảnh. Bộ làm mát loại Peltier sử dụng chất bán dẫn được kẹp giữa hai tấm kim loại. Khi có dòng điện chạy vào, thiết bị hoạt động giống như một máy bơm nhiệt và truyền nhiệt từ CCD.
Nhiễu khuếch đại xảy ra trong thanh ghi khuếch đại của EMCCD và thường được biểu thị bằng đại lượng được gọi là Hệ số nhiễu . Đối với các hệ thống hình ảnh ánh sáng yếu, nhiễu do quá trình nhân hoặc mức tăng có thể là một thông số hiệu suất quan trọng. Quá trình nhân electron khuếch đại các tín hiệu yếu phía trên mức nhiễu cho phép phát hiện các tín hiệu thấp như tín hiệu được tạo ra bởi các sự kiện photon đơn lẻ trong một số trường hợp. Trong bất kỳ quá trình nào mà tín hiệu được khuếch đại, nhiễu được thêm vào tín hiệu cũng được khuếch đại. Vì lý do này, điều quan trọng là phải làm mát EMCCD để giảm dòng điện tối và tiếng ồn liên quan của nó.
Bất cứ khi nào chúng ta tiến hành định lượng các photon hoặc các sự kiện quang điện, đều có sự không chắc chắn cố hữu trong phép đo do bản chất lượng tử của ánh sáng. Sự hấp thụ photon là một hiện tượng cơ học lượng tử và do đó số lượng photon bị hấp thụ thay đổi theo phân bố Poisson. Độ chính xác của việc xác định số lượng photon được hấp thụ bởi một pixel cụ thể về cơ bản bị hạn chế bởi lỗi thống kê cố hữu này. Độ không đảm bảo này được gọi là Poisson, nhiễu thống kê hoặc nhiễu bắn và được tính bằng căn bậc hai của tín hiệu hoặc số lượng quang điện tử được phát hiện. Trong ứng dụng huỳnh quang trong ánh sáng yếu, giá trị trung bình của các pixel sáng nhất có thể thấp tới 16 photon. Do độ không đảm bảo về mặt thống kê hoặc nhiễu Poisson, số lượng quang điện tử thực tế được thu thập trong giếng thế trong khoảng thời gian tích phân có thể dao động trong khoảng từ 12 đến 20 (16 ± 4). Trong các giá trị trung bình biểu thị mức tín hiệu mẫu thấp hơn, độ không đảm bảo sẽ trở nên quan trọng hơn. Ví dụ: nếu giá trị trung bình chỉ là 4 quang điện tử thì phần trăm tín hiệu biểu thị nhiễu thống kê sẽ tăng lên 50 phần trăm (4 ± 2). Poisson hay tiếng ồn khi bắn là một hạn chế vật lý cố hữu. Nhiễu thống kê giảm khi tín hiệu tăng và do đó chỉ có thể giảm bằng cách tăng số lượng sự kiện được đếm. Mặc dù hiệu suất lượng tử thường được xem xét tách biệt khỏi nhiễu, nhưng một giá trị biểu thị số lượng sự kiện cơ học lượng tử giảm đi hàm ý sự gia tăng nhiễu thống kê hoặc nhiễu Poisson.
Hiệu suất lượng tử (QE) là thước đo hiệu suất của máy ảnh xác định phần trăm photon được phát hiện bởi CCD. Nó là một tính chất của phản ứng quang điện và được tóm tắt bằng phương trình sau:
QE = n e /n p (4)
trong đó hiệu suất lượng tử bằng số cặp lỗ electron được tạo ra được xác định bằng số lượng quang điện tử được phát hiện ( n e ) chia cho số lượng photon trung bình (np) tới trên pixel. Hiệu suất lượng tử sẽ luôn nhỏ hơn một.
Số lượng quang điện tử được tạo ra phụ thuộc vào phản ứng quang điện của nguyên tố silicon đối với các photon tới và phụ thuộc vào một số điều kiện. Lượng điện tích được tạo ra trong quá trình tương tác photon silicon phụ thuộc vào một số yếu tố bao gồm hệ số hấp thụ và độ dài khuếch tán. Hệ số hấp thụ của silicon thay đổi khi bước sóng dài hơn thâm nhập sâu hơn vào chất nền silicon so với bước sóng ngắn hơn. Trên bước sóng tới hạn (lớn hơn 1100 nanomet), các photon không đủ năng lượng để tạo ra hiệu ứng quang điện. Các photon trong phạm vi 450 đến 700 nanomet được hấp thụ ở vị trí giếng thế và trong chất nền silicon số lượng lớn. QE của các photon được hấp thụ ở vùng cạn kiệt đạt tới 100% trong khi những photon ở nơi khác trong chất nền có thể giải phóng các electron chuyển động kém hiệu quả hơn.
Độ nhạy quang phổ của CCD phụ thuộc vào QE của các phần tử quang hoạt trong phạm vi bước sóng gần tia cực tím đến hồng ngoại gần, như được minh họa trong Hình 8. Các sửa đổi được thực hiện đối với CCD để tăng hiệu suất đã dẫn đến QE cao ở phần màu xanh lam của quang phổ. CCD được làm mỏng phía sau có thể thể hiện hiệu suất lượng tử lớn hơn 90%, loại bỏ tổn thất do tương tác với các kênh truyền điện tích.
Một phép đo hiệu suất CCD do James Pawley đề xuất được gọi là hàm trải rộng cường độ (ISF) và đo lượng lỗi do nhiễu thống kê trong phép đo cường độ. ISF liên hệ số được đo bằng bộ chuyển đổi A/D với độ sáng của một pixel. ISF cho một máy dò cụ thể được xác định trước tiên bằng cách thực hiện một loạt các phép đo của một pixel trong đó nguồn chiếu sáng đồng đều và các chu kỳ tích phân giống hệt nhau. Sau đó, dữ liệu được vẽ dưới dạng biểu đồ và số lượng photon trung bình cũng như giá trị tại điểm cực đại nửa chiều rộng tối đa (FWHM) (độ lệch chuẩn) được xác định.
ISF bằng giá trị trung bình chia cho FWHM được tính bằng độ lệch chuẩn. Giá trị được biểu thị dưới dạng photon nghĩa là nó đã được hiệu chỉnh theo QE và mối quan hệ tỷ lệ đã biết giữa các quang điện tử và số đại diện của chúng được lưu trong bộ nhớ. Đại lượng được phát hiện và số hóa tỷ lệ thuận với số lượng quang điện tử chứ không phải là photon. Do đó, ISF là thước đo mức độ sai số trong tín hiệu đầu ra do nhiễu thống kê tăng khi QE (tỷ lệ quang điện tử trên photon) giảm. Sai số thống kê biểu thị mức nhiễu tối thiểu có thể đạt được trong hệ thống hình ảnh trong đó nhiễu nhiệt và kết quả đọc đã được giảm thiểu đầy đủ.
Việc chuyển đổi các photon tới thành tín hiệu đầu ra điện tử là một quá trình cơ bản trong CCD. Mối quan hệ lý tưởng giữa đầu vào ánh sáng và đầu ra số hóa cuối cùng là tuyến tính. Là thước đo hiệu suất, độ tuyến tính mô tả mức độ hình ảnh kỹ thuật số cuối cùng thể hiện các đặc điểm thực tế của mẫu vật. Các đặc điểm của mẫu được thể hiện tốt khi giá trị cường độ được phát hiện của pixel có liên quan tuyến tính với giá trị số được lưu trữ và độ sáng của pixel trong màn hình hiển thị hình ảnh. Độ tuyến tính đo lường tính nhất quán mà CCD phản ứng với đầu vào quang tử trên độ sâu giếng của nó. Hầu hết các CCD hiện đại đều thể hiện mức độ phù hợp tuyến tính cao, nhưng độ lệch có thể xảy ra khi các pixel gần hết dung lượng giếng của chúng. Khi các pixel trở nên bão hòa và bắt đầu nở hoa hoặc tràn sang các pixel lân cận hoặc các kênh truyền điện tích, tín hiệu không còn bị ảnh hưởng bởi việc bổ sung thêm các photon và hệ thống trở nên phi tuyến tính.
Đánh giá định lượng độ tuyến tính của CCD có thể được thực hiện bằng cách tạo ra các bộ phơi sáng với thời gian phơi sáng tăng dần bằng cách sử dụng nguồn sáng đồng nhất. Dữ liệu thu được được vẽ với giá trị tín hiệu trung bình là hàm của thời gian phơi sáng (tích hợp). Nếu mối quan hệ là tuyến tính, thì phơi sáng 1 giây tạo ra khoảng 1000 electron dự đoán rằng phơi sáng 10 giây sẽ tạo ra khoảng 10.000 electron. Độ lệch so với độ tuyến tính thường được đo bằng phần trăm nhưng không có hệ thống nào là tuyến tính hoàn hảo trong toàn bộ phạm vi động của nó. Độ lệch so với độ tuyến tính đặc biệt quan trọng trong các ứng dụng định lượng, ánh sáng yếu và để thực hiện hiệu chỉnh trường phẳng. Các phép đo tuyến tính khác nhau giữa các nhà sản xuất và có thể được báo cáo dưới dạng phần trăm tuân thủ hoặc sai lệch so với điều kiện tuyến tính lý tưởng.
Trong các ứng dụng chụp ảnh ánh sáng yếu, tín hiệu huỳnh quang yếu hơn ánh sáng kích thích khoảng một triệu lần. Tín hiệu bị hạn chế hơn nữa về cường độ do nhu cầu giảm thiểu hiện tượng tẩy trắng và nhiễm độc quang. Khi định lượng số lượng nhỏ photon đặc trưng của hình ảnh huỳnh quang sinh học, quá trình này bị thiếu photon nhưng cũng chịu sự không chắc chắn về mặt thống kê liên quan đến việc liệt kê các sự kiện cơ học lượng tử. Phép đo độ tuyến tính còn phức tạp hơn bởi thực tế là mức độ không chắc chắn tăng theo căn bậc hai của cường độ. Điều này có nghĩa là sai số thống kê lớn nhất ở vùng mờ nhất của hình ảnh. Thao tác dữ liệu bằng thuật toán giải mã thường là cách duy nhất để giải quyết vấn đề này trong các ứng dụng hình ảnh hạn chế photon.
Hình ảnh đa chiều
Thuật ngữ hình ảnh đa chiều có thể được sử dụng để mô tả hình ảnh ba chiều (3D; âm lượng), hình ảnh bốn chiều (4D; âm lượng và thời gian) hoặc hình ảnh ở 5 chiều trở lên (5D , 6D , v.v., âm lượng, thời gian, bước sóng ), mỗi đại diện cho sự kết hợp của các biến khác nhau. Các ứng dụng khoa học sinh học hiện đại ngày càng yêu cầu các thiết bị quang học và hệ thống xử lý hình ảnh kỹ thuật số có khả năng thu thập thông tin định lượng, đa chiều về các mẫu vật động, phức tạp về mặt không gian. Phân tích hình ảnh định lượng, đa chiều đã trở nên cần thiết cho nhiều ứng dụng khoa học sinh học. Hình ảnh của các vật thể có độ phân giải phụ, động học nhanh và các quá trình sinh học động đặt ra những thách thức kỹ thuật cho các nhà sản xuất thiết bị để tạo ra các thiết bị xử lý và thu nhận hình ảnh cực kỳ nhạy, cực nhanh và chính xác.
Hình ảnh do kính hiển vi tạo ra và chiếu lên bề mặt máy dò là hình ảnh hai chiều của một vật thể tồn tại trong không gian ba chiều. Như đã thảo luận trong Phần I, hình ảnh được chia thành một mảng pixel hai chiều, được biểu thị bằng đồ họa bằng trục x và y . Mỗi pixel là một khu vực hình vuông điển hình được xác định bởi độ phân giải ngang và độ phóng đại của kính hiển vi cũng như kích thước vật lý của mảng máy dò. Tương tự như pixel trong hình ảnh 2D, phần tử khối hoặc voxel, có kích thước được xác định bởi các trục x, y và z , là đơn vị cơ bản hoặc khối lượng lấy mẫu trong hình ảnh 3D. Một điểm ảnh ba chiều biểu thị một phần quang học, được chụp ảnh bằng kính hiển vi, bao gồm vùng được phân giải trong mặt phẳng x – y và khoảng cách dọc theo trục z được xác định bởi độ sâu trường ảnh, như minh họa trong Hình 9. Để minh họa khái niệm điểm ảnh ba chiều (Hình 9), một đối tượng điểm huỳnh quang có độ phân giải phụ có thể được mô tả theo ba chiều bằng hệ tọa độ, như minh họa trong Hình 9(a). Độ sâu tiêu cự điển hình của kính hiển vi quang học được thể hiện tương ứng với kích thước của virus, vi khuẩn và nhân tế bào động vật có vú trong Hình 9(b), trong khi Hình 9(c) mô tả sơ đồ của một hình ảnh điểm có độ phân giải phụ được chiếu lên một mảng 25 pixel. Các pixel được kích hoạt (những pixel nhận photon) trải rộng trên một chiều lớn hơn nhiều so với nguồn điểm ban đầu.
Độ sâu trường ảnh là phép đo không gian vật thể song song với trục quang. Nó mô tả khả năng phân giải trục, phụ thuộc vào khẩu độ của vật kính hiển vi và được định nghĩa là khoảng cách giữa các vật thể gần nhất và xa nhất khi lấy nét đồng thời. Khẩu độ số (NA) của vật kính hiển vi được xác định bằng cách nhân sin của một nửa khẩu độ góc với chỉ số khúc xạ của môi trường tạo ảnh. Độ phân giải bên thay đổi nghịch đảo với lũy thừa đầu tiên của NA, trong khi độ phân giải trục có liên quan nghịch với bình phương của NA. Do đó NA ảnh hưởng đến độ phân giải trục nhiều hơn so với độ phân giải bên. Trong khi độ phân giải không gian chỉ phụ thuộc vào NA, hình học voxel phụ thuộc vào độ phân giải không gian được xác định bởi NA và độ phóng đại của vật kính, cũng như kích thước vật lý của dãy máy dò. Ngoại trừ hình ảnh đa photon, sử dụng thể tích voxel femtoliter, kính hiển vi trường rộng và kính hiển vi đồng tiêu được giới hạn ở kích thước khoảng 0,2 micromet x 0,2 micromet x 0,4 micromet dựa trên vật kính NA cao nhất hiện có.
Các vật thể có kích thước vi-rút nhỏ hơn giới hạn độ phân giải quang học có thể được phát hiện nhưng độ phân giải kém. Trong các mẫu dày hơn, chẳng hạn như tế bào và mô, có thể lấy mẫu liên tục ở các lớp sâu hơn liên tiếp để mỗi phần quang học đóng góp vào một chuỗi z (hoặc ngăn z ). Kính hiển vi được trang bị động cơ bước điều khiển bằng máy tính thu được hình ảnh, sau đó điều chỉnh tiêu điểm theo các thông số lấy mẫu, chụp một hình ảnh khác và tiếp tục cho đến khi thu thập được số lượng phần quang học đủ lớn. Kích thước bước có thể điều chỉnh được và sẽ phụ thuộc vào việc lấy mẫu Nyquist thích hợp, như đối với hình ảnh 2D. Giới hạn độ phân giải trục lớn hơn giới hạn độ phân giải ngang. Điều này có nghĩa là voxel có thể không phải là một khối lập phương có cạnh bằng nhau và sẽ có kích thước z có thể lớn hơn nhiều lần so với kích thước x và y . Ví dụ, một mẫu vật có thể được chia thành các phần quang học dày 5 micromet và lấy mẫu ở các khoảng cách 20 micromet. Nếu kích thước x và y là 0,5 micromet x 0,5 micromet thì voxel thu được sẽ dài hơn 40 lần so với chiều rộng.
Hình ảnh ba chiều có thể được thực hiện bằng kính hiển vi huỳnh quang trường rộng thông thường được trang bị cơ chế thu được các phần quang học tuần tự. Các vật thể trong mặt phẳng tiêu điểm được tiếp xúc với nguồn chiếu sáng và ánh sáng phát ra từ fluorophore được máy dò thu thập. Quá trình này được lặp lại ở các khoảng lấy nét chính xác dọc theo trục z , thường là hàng trăm lần và một chuỗi các phần quang học hoặc chuỗi z (cũng là ngăn xếp z ) được tạo ra. Trong hình ảnh trường rộng của các mẫu sinh học dày, ánh sáng mờ và tán xạ có thể làm giảm chất lượng hình ảnh ở cả ba chiều.
Kính hiển vi đồng tiêu có một số ưu điểm khiến nó trở thành một công cụ được sử dụng phổ biến trong kính hiển vi huỳnh quang đa chiều. Ngoài độ phân giải theo trục và ngang tốt hơn một chút, kính hiển vi đồng tiêu quét laser (LSCM) còn có độ sâu trường ảnh có thể kiểm soát được, loại bỏ các bước sóng không mong muốn và ánh sáng ngoài tiêu cự, đồng thời có thể lấy mẫu mịn các mẫu vật dày. Một hệ thống gương lưỡng sắc được điều khiển bằng điện kế, được điều khiển bằng máy tính sẽ hướng hình ảnh của khẩu độ lỗ kim xuyên qua trường nhìn, theo mô hình raster tương tự như mô hình được sử dụng trong truyền hình. Một lỗ kim thoát được đặt trong mặt phẳng liên hợp tới điểm trên đối tượng được quét. Chỉ có ánh sáng phát ra từ vật thể điểm mới được truyền qua lỗ kim và đến được phần tử máy dò. Độ dày của phần quang học có thể được kiểm soát bằng cách điều chỉnh đường kính của lỗ kim ở phía trước máy dò, một tính năng giúp tăng cường tính linh hoạt trong việc chụp ảnh mẫu vật sinh học. Những cải tiến về công nghệ như quét và chụp bằng laser được điều khiển bằng máy tính và điện tử, cũng như các biến thể trong thiết kế của các thiết bị (chẳng hạn như đĩa quay, nhiều phiên bản quét lỗ kim và khe) đã tăng tốc độ thu nhận hình ảnh. Việc thu nhận nhanh hơn và kiểm soát tia laser tốt hơn bằng cách tắt chùm tia làm giảm tổng hiệu ứng phơi sáng trên các tế bào nhạy cảm với ánh sáng, cố định hoặc sống. Điều này cho phép sử dụng các dải ánh sáng laser cường độ cao, hẹp để thâm nhập sâu hơn vào các mẫu vật dày, làm cho kính hiển vi đồng tiêu phù hợp với các ứng dụng hình ảnh đa chiều, phân giải theo thời gian.
Đối với các ứng dụng đa chiều trong đó mẫu vật rất nhạy cảm với bước sóng khả kiến, thể tích mẫu hoặc nồng độ fluorophore cực kỳ nhỏ hoặc khi chụp ảnh qua mẫu mô dày, kính hiển vi đa photon quét laser (LSMM) ; thường được gọi đơn giản là kính hiển vi đa photon) đôi khi được sử dụng . Mặc dù hoạt động quét tương tự như hoạt động của thiết bị đồng tiêu, LSMM sử dụng nguồn chiếu sáng hồng ngoại để kích thích thể tích mẫu femtoliter chính xác (khoảng 10 -15 ). Các photon được tạo ra bởi tia laser hồng ngoại và được định vị trong một quá trình được gọi là sự đông tụ photon. Sự hấp thụ đồng thời của hai photon năng lượng thấp đủ để kích thích chất phát huỳnh quang và khiến nó phát ra ở đặc tính của nó, làm thay đổi bước sóng. Ánh sáng kích thích có bước sóng dài hơn ít gây ra hiện tượng tẩy quang và nhiễm độc quang, do đó làm giảm tán xạ Rayleigh nên thâm nhập sâu hơn vào các mẫu vật sinh học. Do kích thước voxel nhỏ, tại một thời điểm, ánh sáng chỉ được phát ra từ một điểm giới hạn nhiễu xạ, cho phép phân chia quang học rất tinh tế và chính xác. Vì không có sự kích thích của fluorophores ở trên hoặc dưới mặt phẳng tiêu cự nên hình ảnh đa photon ít bị ảnh hưởng bởi nhiễu và suy giảm tín hiệu. Việc không có khẩu độ lỗ kim có nghĩa là phát hiện được nhiều photon phát ra hơn, trong các ứng dụng thiếu photon điển hình của hình ảnh đa chiều, có thể bù đắp chi phí cao hơn của hệ thống hình ảnh đa photon.
Chuỗi z thường được sử dụng để biểu thị các phần quang học của chuỗi thời gian trôi đi trong đó trục z biểu thị thời gian. Kỹ thuật này thường được sử dụng trong sinh học phát triển để hình dung những thay đổi sinh lý trong quá trình phát triển phôi. Hình ảnh tế bào sống hoặc quá trình động thường tạo ra các tập dữ liệu 4D. Dữ liệu thể tích được giải quyết theo thời gian này được hiển thị bằng các chương trình xem 4D và có thể được xây dựng lại, xử lý và hiển thị dưới dạng hình ảnh chuyển động hoặc dựng phim. Năm chiều trở lên có thể được chụp ảnh bằng cách thu được các bộ 3 hoặc 4 chiều ở các bước sóng khác nhau bằng cách sử dụng các chất huỳnh quang khác nhau. Các phần quang học đa bước sóng sau đó có thể được kết hợp thành một hình ảnh duy nhất của các cấu trúc riêng biệt trong mẫu vật đã được dán nhãn bằng các chất huỳnh quang khác nhau. Hình ảnh đa chiều có thêm lợi thế là có thể xem hình ảnh trong mặt phẳng xz dưới dạng một mặt cắt hoặc lát cắt dọc.
Hiển thị và lưu trữ hình ảnh kỹ thuật số
Thành phần hiển thị của hệ thống hình ảnh đảo ngược quá trình số hóa được thực hiện trong bộ chuyển đổi A/D. Mảng số biểu thị cường độ tín hiệu hình ảnh phải được chuyển đổi trở lại thành tín hiệu tương tự (điện áp) để có thể xem trên màn hình máy tính. Một vấn đề nảy sinh khi hàm (sin(x)/x) biểu diễn dạng sóng của thông tin số phải được tạo để phù hợp với đường cong Gaussian đơn giản hơn của điểm quét màn hình. Để thực hiện thao tác này mà không làm mất thông tin không gian, các giá trị cường độ của từng pixel phải trải qua phép nội suy, một kiểu khớp đường cong toán học. Những thiếu sót liên quan đến việc nội suy tín hiệu có thể được bù đắp một phần bằng cách sử dụng màn hình có độ phân giải cao có băng thông lớn hơn 20 megaHertz, giống như hầu hết các màn hình máy tính hiện đại. Việc tăng số lượng pixel được sử dụng để thể hiện hình ảnh bằng cách lấy mẫu vượt quá giới hạn Nyquist (lấy mẫu quá mức) sẽ làm tăng dữ liệu pixel có sẵn để xử lý và hiển thị hình ảnh.
Một số công nghệ khác nhau có sẵn để hiển thị hình ảnh kỹ thuật số mặc dù các ứng dụng hình ảnh hiển vi thường sử dụng màn hình dựa trên công nghệ ống tia âm cực (CRT) hoặc màn hình tinh thể lỏng (LCD). Các công nghệ hiển thị này được phân biệt bởi loại tín hiệu mà mỗi tín hiệu nhận được từ máy tính. Màn hình LCD chấp nhận tín hiệu số bao gồm các xung điện nhanh được hiểu là một chuỗi chữ số nhị phân (0 hoặc 1). Màn hình CRT chấp nhận tín hiệu tương tự và do đó yêu cầu bộ chuyển đổi kỹ thuật số sang tương tự (DAC) đặt trước màn hình trong quá trình xử lý hình ảnh.
Hình ảnh kỹ thuật số có thể được lưu trữ ở nhiều định dạng tệp khác nhau đã được phát triển để đáp ứng các yêu cầu khác nhau. Định dạng được sử dụng tùy thuộc vào loại hình ảnh và cách nó được trình bày. Hình ảnh chất lượng, độ phân giải cao yêu cầu kích thước tệp lớn. Kích thước tệp có thể được giảm bằng một số thuật toán nén khác nhau nhưng dữ liệu hình ảnh có thể bị mất tùy theo loại. Nén không mất dữ liệu (chẳng hạn như Định dạng tệp hình ảnh được gắn thẻ; TIFF ) mã hóa thông tin hiệu quả hơn bằng cách xác định các mẫu và thay thế chúng bằng mã ngắn. Các thuật toán này có thể giảm hình ảnh gốc khoảng 50 đến 75 phần trăm. Kiểu nén tệp này có thể tạo điều kiện thuận lợi cho việc truyền và chia sẻ hình ảnh, đồng thời cho phép giải nén và khôi phục các thông số hình ảnh gốc. Các thuật toán nén tổn thất, chẳng hạn như thuật toán được sử dụng để xác định các tệp hình ảnh JPEG trước năm 2000, có khả năng giảm hình ảnh xuống dưới 1% kích thước ban đầu của chúng. Định dạng JPEG 2000 sử dụng cả hai kiểu nén. Việc giảm lớn được thực hiện bằng một kiểu lấy mẫu dưới trong đó các bước mức xám không thể nhận thấy được loại bỏ. Vì vậy, sự lựa chọn thường là sự dung hòa giữa chất lượng hình ảnh và khả năng quản lý.
Hình ảnh dựa trên bản đồ bit hoặc raster được tạo ra bởi máy ảnh kỹ thuật số, màn hình và thiết bị đầu ra in truyền thông tin pixel một cách tuần tự. Hình ảnh màu 24 bit (RGB) sử dụng 8 bit cho mỗi kênh màu tạo ra 256 giá trị cho mỗi màu với tổng số 16,7 triệu màu. Mảng độ phân giải cao 1280 x 1024 pixel thể hiện hình ảnh 24 bit màu thực sẽ cần nhiều hơn 3,8 megabyte dung lượng lưu trữ. Các loại tệp dựa trên raster thường được sử dụng bao gồm GIF, TIFF và JPEG. Hình ảnh dựa trên vector được xác định về mặt toán học và được sử dụng chủ yếu để lưu trữ hình ảnh được tạo bởi phần mềm vẽ và hoạt hình. Hình ảnh vector thường yêu cầu ít không gian lưu trữ hơn và có thể chuyển đổi và thay đổi kích thước. Các định dạng siêu tệp, chẳng hạn như PDF, có thể kết hợp các tệp được tạo bởi cả hình ảnh dựa trên raster và vector. Định dạng tệp này rất hữu ích khi hình ảnh phải được hiển thị nhất quán trong nhiều ứng dụng khác nhau hoặc được chuyển giữa các hệ điều hành khác nhau.
Khi độ phức tạp về chiều của hình ảnh tăng lên, kích thước tệp hình ảnh có thể trở nên rất lớn. Đối với một màu, kích thước tệp hình ảnh 2048 x 2048 thường là khoảng 8 megabyte. Một hình ảnh nhiều màu có cùng độ phân giải có thể đạt tới 32 megabyte. Đối với hình ảnh có 3 chiều không gian và nhiều màu sắc, hình ảnh nhỏ có thể yêu cầu dung lượng lưu trữ 120 megabyte trở lên. Trong hình ảnh tế bào sống, nơi phân giải thời gian, hình ảnh đa chiều được thu thập, tệp hình ảnh có thể trở nên cực kỳ lớn. Ví dụ: một thử nghiệm sử dụng 10 vị trí giai đoạn, được chụp ảnh trong 24 giờ với 3-5 màu ở một khung hình mỗi phút, kích thước khung hình 1024 x 1024 và hình ảnh 12 bit có thể lên tới 86 gigabyte mỗi ngày! Hình ảnh đồng tiêu tốc độ cao với các mảng lưu trữ đặc biệt có thể tạo ra tới 100 gigabyte mỗi giờ. Các tệp hình ảnh có kích thước và độ phức tạp này phải được sắp xếp và lập chỉ mục và thường yêu cầu các thư mục lớn với hàng trăm nghìn hình ảnh được lưu trong một thư mục khi chúng được truyền trực tuyến từ máy ảnh kỹ thuật số. Ổ cứng hiện đại có khả năng lưu trữ ít nhất 500 gigabyte. Số lượng hình ảnh có thể được lưu trữ tùy thuộc vào kích thước của tệp hình ảnh. Khoảng 250.000 hình ảnh 2-3 megabyte có thể được lưu trữ trên hầu hết các ổ cứng hiện đại. Lưu trữ bên ngoài và sao lưu có thể được thực hiện bằng cách sử dụng đĩa compact ( CD ) chứa khoảng 650 megabyte hoặc DVD có dung lượng 5,2 gigabyte. Phân tích hình ảnh thường mất nhiều thời gian hơn so với việc thu thập và hiện bị giới hạn bởi bộ nhớ máy tính và tốc độ ổ đĩa. Việc lưu trữ, tổ chức, lập chỉ mục, phân tích và trình bày sẽ được cải thiện khi có bộ đa xử lý 64 bit với lõi bộ nhớ lớn.
Nguồn:
Công ty Minh Khang là nhà phân phối độc quyền thị trường miền Nam phân khúc kính hiển vi hãng Carl ZEISS.
EN