Kiểm tra định kỳ Mycoplasma là một phần cần thiết để đảm bảo chất lượng và an toàn của sản phẩm dược phẩm sinh học. Bài viết này sẽ mô tả ứng dụng của BIOFIRE FILMARRAY® – một công nghệ được công nhận rộng rãi, dùng trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm để phát hiện nhanh chóng Mycoplasmas trong ngành dược phẩm.

Mycoplasmas (tức là Mollicutes) là những vi khuẩn gây ô nhiễm phổ biến trong nuôi cấy tế bào nhân chuẩn, đặc biệt khó phát hiện và loại bỏ. Sự hiện diện của chúng có thể tác động tiêu cực đến sức khỏe của tế bào trong môi trường nuôi cấy, làm giảm năng suất lò phản ứng sinh học, cản trở các xét nghiệm in vitro và trong một số trường hợp có thể gây bệnh. Các phương pháp xét nghiệm Mycoplasma dựa vào kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn, phải mất tới 28 ngày mới có kết quả kết quả.

Những phương pháp này không chỉ đòi hỏi thời gian ủ bệnh đáng kể mà việc nhân giống tế bào vi khuẩn Mycoplasma sống còn gây ra rủi ro lây nhiễm đáng kể cho cơ sở sản xuất. Theo đó, xét nghiệm Mycoplasma thể hiện một nút thắt phổ biến trong quá trình sản xuất và trong trường hợp các sản phẩm có thời hạn sử dụng ngắn như liệu pháp tế bào, xét nghiệm Mycoplasma bổ sung có thể không phù hợp.

Nhận thấy nhu cầu về các phương pháp xét nghiệm nhanh hơn, dược điển đã cung cấp hướng dẫn về việc sử dụng Xét nghiệm dựa trên Axit Nucleic Mycoplasma (NAT) thay thế cho các phương pháp bổ sung để xét nghiệm xuất xưởng lô hàng. Với kết quả có thể có trong vòng vài ngày hoặc vài giờ, thay vào đó Trong vài tuần, việc sử dụng Mycoplasma NAT cũng mang lại khả năng thử nghiệm trong quá trình như một phần của quy trình kiểm soát ô nhiễm rộng hơn nhằm giảm rủi ro và cải thiện việc ra quyết định trong suốt quá trình sản xuất (phù hợp với tiêu chuẩn PAT và QbD). Tuy nhiên, NAT thông thường vẫn cần nhiều thời gian thực hiện từ những người vận hành có tay nghề cao cùng với phòng thí nghiệm chuyên dụng, do đó việc thử nghiệm tại dây chuyền sản xuất vẫn chưa khả thi để giám sát ô nhiễm Mycoplasma gần thời gian thực.

Ngược lại với các NAT thông thường, Giải pháp BIOFIRE® Mycoplasma (Hình 1) cung cấp một hệ thống NAT – phòng thí nghiệm khép kín, hoàn toàn tự động, dễ sử dụng và yêu cầu thời gian thực hành khoảng năm phút. Túi BIOFIRE Mycoplasma (Hình 2) dùng một lần, kín, chứa tất cả các thuốc thử cần thiết cho quá trình ly giải tế bào tự động, tinh chế axit nucleic, phiên mã ngược, phản ứng chuỗi polymerase (PCR) giai đoạn một và giai đoạn hai, cũng như phát hiện chất phân tích để cô lập, khuếch đại và phát hiện axit nucleic Mycoplasma từ một mẫu duy nhất.

Túi chạy trên thiết bị FILMARRAY® 2.0 nhỏ gọn, tự động hóa tất cả các bước từ ly giải tế bào đến phát hiện chất phân tích, với kết quả cuối cùng có được sau khoảng 45 phút sau khi bắt đầu chạy. Người vận hành có thể quét thông tin về túi và mẫu vào thiết bị bằng đầu đọc mã vạch cầm tay hoặc nhập thủ công. Vào cuối mỗi lần chạy, một báo cáo kiểm tra tự động sẽ được tạo ra để thông báo cho người dùng xem Mycoplasma có được phát hiện trong mẫu hay không.

Mỗi túi bao gồm 14 xét nghiệm PCR khác nhau để bao quát sự đa dạng di truyền rộng rãi của lớp Mollicutes, với hơn 130 loài được phát hiện. Ba biện pháp kiểm soát nội bộ đảm bảo độ tin cậy của kết quả bằng cách giám sát tất cả các khía cạnh của chức năng túi, từ trích xuất mẫu cho đến phát hiện khuếch đại. Hệ thống này được thiết kế để đáp ứng các tiêu chuẩn xét nghiệm bổ sung, với các nghiên cứu về Giới hạn Phát hiện (LoD) được thực hiện đối với Mycoplasmas được liệt kê trong dược điển Hoa Kỳ, Châu Âu và Nhật Bản sử dụng thể tích mẫu 10 mL và 0,2 mL. Giá trị LoD cho 10 mL mẫu nằm trong khoảng từ <1 CFU/ mL đến 10 CFU/ mL đối với tất cả 10 loại Mycoplasma bổ sung được thử nghiệm, chỉ cần một vài bước tiền xử lý đơn giản bằng cách ly tâm. Thử nghiệm trực tiếp 0,2 mL mẫu cung cấp các giá trị LoD từ 1 đến 33 CFU/mL và nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho việc giám sát thường xuyên hơn các nguyên liệu thô, ngân hàng tế bào, sản phẩm trung gian ban đầu và sinh phẩm có khối lượng sẵn có hạn chế.

Độ đặc hiệu được đánh giá bằng cách kiểm tra nồng độ cao của các vi khuẩn không phải mục tiêu có liên quan chặt chẽ với lớp Mollicutes, bao gồm các loài Bacillus, Clostridium, Lactobacillus và Streptococcus. Không có kết quả dương tính giả nào được quan sát ở mức ≤1E+06 CFU/mL đối với tất cả các sinh vật được xét nghiệm, chứng tỏ tính đặc hiệu cao của xét nghiệm. Ngoài ra, một loạt các chất khác nhau liên quan đến sản xuất dược phẩm sinh học đã được kiểm tra về khả năng gây nhiễu đối với độ chính xác của kết quả.

Để đạt được mục đích này, các chất đã được thử nghiệm không thêm chuẩn (để trống) và thêm thêm năm loại Mollicutes khác nhau (A. Laylawii, M. fermentans, M. orale, M. pneumonia, S. citri) ở 3xLoD. Không quan sát thấy sự can thiệp vào các biện pháp kiểm soát đối với bất kỳ chất thử nghiệm nào và tất cả các Mycoplasma đều được phát hiện thành công, ngoại trừ chất tẩy được phát hiện là gây cản trở việc phát hiện Mycoplasma khi đưa vào mẫu ở mức 1% thể tích mẫu cuối cùng. Do đó, cần hết sức cẩn thận trong trường hợp sử dụng thuốc tẩy gần địa điểm xét nghiệm hoặc lấy mẫu.

Độ bền của Giải pháp BIOFIRE® Mycoplasma được đánh giá bằng cách tạo ra những thay đổi nhỏ trong các thông số phương pháp mà người vận hành có thể đưa ra trong quá trình sử dụng thông thường, điều này cho thấy không có kết quả xét nghiệm Mycoplasma sai sót. Thử nghiệm độ chắc chắn cũng xác nhận sự thiếu ảnh hưởng của các biến số vận hành và môi trường đến khả năng tái tạo kết quả thử nghiệm, bao gồm các nhà phân tích khác nhau, các lô túi khác nhau, các thiết bị FILMARRAY® khác nhau và nhiều ngày thử nghiệm.

Kết hợp lại với nhau, hiệu suất phân tích đặc hiệu và có độ nhạy cao, kết quả tự động nhanh và thiết kế hệ thống nhỏ gọn của Giải pháp BIOFIRE® Mycoplasma thể hiện tiềm năng đặc biệt để thử nghiệm Mycoplasma trong quy trình tại dây chuyền với kết quả gần như thời gian thực. Với thời gian thực hiện khoảng năm phút và báo cáo kết quả tự động trong khoảng một giờ, hệ thống đơn giản hóa việc triển khai thử nghiệm Mycoplasma để cải thiện việc giám sát Mycoplasma trong suốt quá trình sản xuất.

Dễ dàng: Thời gian thực hiện chưa đầy năm phút; một bảng thử nghiệm cho mỗi mẫu.

Nhanh: Thời gian chạy thiết bị và kết quả kiểm tra có trong vòng chưa đầy 1 giờ.

Phát hiện rộng: Bao gồm sự đa dạng di truyền trên lớp Mollicutes.

Nhạy: Phát hiện Mycoplasma bổ sung ở mức 10 CFU/mL.

Hệ thống khép kín: Trích xuất mẫu tự động, PCR ghép kênh lồng nhau, báo cáo kết quả và giảm nguy cơ ô nhiễm.

Tính linh hoạt của thể tích mẫu: Quá trình xử lý trước mẫu đơn giản cho phép thể tích mẫu nằm trong khoảng từ 0,2 mL đến 10 mL hoặc thậm chí cao hơn.

Nhiệt độ phòng ổn định: Bảo quản thuốc thử ở 18-30°C

Thiết bị nhỏ gọn: 25,4 x 39,3 x 16,5 cm (10 x 15,5 x 6,5 in)

Phần mềm: Tuân thủ 21 CFR 11

Nguồn:

Minh Khang là nhà phân phối độc quyền giải pháp Dược phẩm hãng BioMérieux (Pháp).