Giới thiệu hệ thống tạo ảnh trong kính hiển vi

Trong kính hiển vi quang học, khi ánh sáng từ nguồn chiếu sáng đi qua tụ điện rồi đi qua mẫu vật, một số ánh sáng truyền xung quanh và xuyên qua mẫu vật mà không bị xáo trộn trên đường đi của nó. Ánh sáng này được gọi là ánh sáng trực tiếp, không bị lệch hoặc không bị nhiễu xạ và đại diện cho ánh sáng nền. Một số ánh sáng tương tác với mẫu vật bị lệch hoặc nhiễu xạ. Ánh sáng nhiễu xạ được tạo ra bằng một nửa bước sóng hoặc lệch pha 180 độ với ánh sáng trực tiếp truyền qua mà không gặp chướng ngại vật. Một nửa bước sóng lệch pha, do chính mẫu vật gây ra, cho phép ánh sáng này gây ra sự giao thoa triệt tiêu với ánh sáng trực tiếp khi cả hai đi tới mặt phẳng hình ảnh trung gian nằm ở màng chắn cố định của thị kính. Thấu kính của thị kính phóng to thêm hình ảnh này, cuối cùng được chiếu lên võng mạc, màng phim của máy ảnh hoặc bề mặt của cảm biến hình ảnh kỹ thuật số nhạy sáng.

Điều đã xảy ra là ánh sáng trực tiếp hoặc không bị lệch được chiếu bởi vật kính và trải đều trên toàn bộ mặt phẳng ảnh ở màng chắn của thị kính. Ánh sáng nhiễu xạ bởi mẫu vật giao thoa với mặt phẳng tiêu cự phía sau vật kính (xem Hình 1) và được tập trung tại các vị trí cục bộ khác nhau trên cùng một mặt phẳng hình ảnh, trong đó ánh sáng nhiễu xạ gây ra giao thoa triệt tiêu và làm giảm cường độ, dẫn đến tạo ra một mẫu chứa phổ rộng các giá trị thang độ xám từ rất tối đến rất sáng. Những mô hình sáng và tối này là những gì chúng ta nhận ra là hình ảnh của mẫu vật. Bởi vì mắt chúng ta rất nhạy cảm với những thay đổi về độ sáng nên hình ảnh trở thành sự tái tạo ít nhiều trung thực với mẫu vật ban đầu.

Những thí nghiệm này được thực hiện dễ dàng nhất bằng cách sử dụng micromet giai đoạn hoặc cách tử tương tự gồm các vạch tối có khoảng cách gần nhau. Để tiếp tục, đặt cách tử lên bàn soi của kính hiển vi và đưa nó vào tiêu điểm trước tiên bằng cách sử dụng vật kính 10x và sau đó là vật kính 40x. Tháo thị kính và lắp kính thiên văn pha vào vị trí của nó để có thể quan sát được mặt phẳng tiêu cự phía sau của vật kính. Nếu màng chắn khẩu độ tụ quang được đóng gần hết, một điểm sáng trắng ở giữa sẽ xuất hiện ở phía sau vật kính, đó là hình ảnh của màng chắn khẩu độ. Ở bên phải và bên trái của điểm trung tâm, sẽ xuất hiện một loạt quang phổ nhiễu xạ (cũng là hình ảnh của màng chắn khẩu độ, được trình bày trong Hình 1), mỗi quang phổ có màu xanh lam ở phần gần điểm trung tâm nhất và có màu đỏ ở phần quang phổ xa nhất so với điểm sáng trung tâm (như minh họa trong Hình 2). Cường độ của các quang phổ màu này giảm tùy theo khoảng cách giữa quang phổ và điểm trung tâm.

Những phổ nhiễu xạ rơi gần ngoại vi của vật kính sẽ mờ hơn những phổ nhiễu xạ ở gần điểm trung tâm. Phổ nhiễu xạ được minh họa trong Hình 2 được ghi lại bằng ba độ phóng đại vật kính khác nhau. Trong Hình 2(b), mẫu nhiễu xạ nhìn thấy được ở mặt phẳng tiêu cự phía sau của vật kính 10x chứa hai phổ nhiễu xạ. Nếu cách tử được loại bỏ khỏi bàn soi, như minh họa trong Hình 2(a), những quang phổ này sẽ biến mất và chỉ còn lại hình ảnh trung tâm của màng chắn khẩu độ. Nếu lắp lại cách tử, quang phổ sẽ xuất hiện lại một lần nữa. Lưu ý rằng khoảng cách giữa các quang phổ màu có vẻ tối. Chỉ có thể quan sát được một cặp quang phổ nếu cách tử được kiểm tra bằng vật kính 10x. Trong trường hợp này, một điểm nhiễu xạ xuất hiện ở bên trái và một điểm nhiễu xạ xuất hiện ở bên phải lỗ mở trung tâm. Nếu cách tử vạch được kiểm tra với vật kính 40x (như trong Hình 2(c)), một số phổ nhiễu xạ xuất hiện ở bên trái và bên phải của khẩu độ trung tâm. Khi độ phóng đại tăng lên 60x hoặc 63x (và giả sử nó có khẩu độ số cao hơn vật kính 40x), một số quang phổ bổ sung (xem Hình 2(d)) xuất hiện ở bên phải và bên trái của những quang phổ nhìn thấy được với vật kính 40x. tại chỗ.

Bởi vì quang phổ màu biến mất khi loại bỏ cách tử, có thể giả định rằng chính mẫu vật đang ảnh hưởng đến ánh sáng truyền qua, do đó tạo ra quang phổ màu. Hơn nữa, nếu màng chắn khẩu độ được đóng lại ở kích thước mở rất nhỏ, chúng ta sẽ quan sát thấy vật kính có khẩu độ số cao hơn thu được nhiều quang phổ màu này hơn so với vật kính có khẩu độ số thấp hơn. Tầm quan trọng cốt yếu của hai khái niệm này đối với việc hiểu sự hình thành hình ảnh sẽ trở nên rõ ràng trong các đoạn văn tiếp theo. Điểm sáng trung tâm (hình ảnh của màng ngăn tụ quang) thể hiện ánh sáng trực tiếp hoặc không lệch hướng đi qua mẫu vật hoặc xung quanh mẫu vật mà không bị nhiễu loạn (minh họa trong Hình 3(b)). Nó được gọi là bậc 0. Các hình ảnh mờ hơn của màng chắn khẩu độ ở mỗi bên của bậc 0 được gọi lần lượt là bậc 1, 2, 3, 4, v.v., như được biểu thị bằng mẫu nhiễu xạ mô phỏng trong Hình 3(a), sẽ được quan sát ở mặt phẳng tiêu cự phía sau của vật kính 40x. Trong trường hợp này, tất cả các thứ tự được ghi lại thể hiện kiểu nhiễu xạ của cách tử đường như được thấy ở mặt phẳng tiêu phía sau của vật kính.

Các hình ảnh nhiễu xạ mờ hơn của màng chắn khẩu độ là do các mặt sóng nhiễu xạ, trải ra theo hình quạt, tại mỗi lỗ mở của cách tử (Hình 3(b)). Các bước sóng màu xanh lam bị nhiễu xạ ở góc nhỏ hơn các bước sóng màu xanh lá cây, bị nhiễu xạ ở góc nhỏ hơn các bước sóng màu đỏ. Ở mặt phẳng tiêu cự phía sau của vật kính, các bước sóng màu xanh từ mỗi khe giao thoa tăng cường để tạo ra vùng màu xanh lam của ảnh nhiễu xạ của từng quang phổ hoặc bậc. Các vùng màu đỏ và xanh lục (Hình 3(a)) cách nhau xa hơn một chút, nhưng đều xuất phát từ cùng một hiện tượng. Trong trường hợp các bước sóng nhiễu xạ lệch một nửa bước sóng đối với mỗi màu này, các sóng giao thoa triệt tiêu để tạo ra các vùng tối giữa quang phổ hoặc các trật tự. Tại vị trí bậc 0, tất cả các bước sóng từ mỗi khe cộng lại một cách tăng cường. Điều này tạo ra ánh sáng trắng sáng mà bạn nhìn thấy ở bậc 0 (xem Hình 2, 3 và 4) ở tâm của mặt phẳng tiêu cự phía sau của vật kính.

Khoảng cách của cách tử vạch càng gần thì quang phổ sẽ được thu bởi một vật kính nhất định càng ít, như được minh họa trong Hình 4 (ac). Mẫu nhiễu xạ được minh họa trong Hình 4(a) được ghi lại bằng hình ảnh vật kính 40x ở phần dưới của cách tử đường trong Hình 4(b), trong đó các khe gần nhau hơn. Trong Hình 4(c), vật kính được tập trung vào phần trên của cách tử đường (Hình 4(b)) trong đó các khe cách xa nhau hơn và vật kính thu được nhiều quang phổ hơn. Ánh sáng trực tiếp và ánh sáng từ cực đại nhiễu xạ bậc cao được vật kính hội tụ để tạo thành ảnh trong mặt phẳng ảnh trung gian tại màng chắn cố định của thị kính. Ở đây, các tia sáng trực tiếp và nhiễu xạ giao thoa và do đó được tái tạo thành hình ảnh thật, đảo ngược được thấu kính của thị kính nhìn thấy và được phóng đại thêm. Điều này được minh họa từ Hình 4(d) đến Hình 4(g) với hai loại cách tử nhiễu xạ. Lưới vuông được minh họa trong Hình 4(d) thể hiện hình ảnh trực giao của lưới (trong thực tế, hình ảnh mẫu vật thông thường được quan sát qua thị kính) khi nhìn qua khẩu độ đầy đủ của vật kính. Mẫu nhiễu xạ thu được từ lưới này được biểu diễn dưới dạng ảnh hình nón có thể nhìn thấy ở mặt phẳng tiêu phía sau của vật kính (Hình 4(e)). Tương tự như vậy, ảnh trực giao của một lưới được sắp xếp theo hình lục giác (Hình 4(f)) tạo ra ảnh hình nón được sắp xếp theo hình lục giác tương ứng (Hình 4(g)) của các mẫu nhiễu xạ bậc nhất.

Ánh sáng nhiễu xạ và độ phân giải

Các mẫu kính hiển vi có thể được coi là các đường hoặc mẫu phức tạp với các chi tiết và lỗ mở có phạm vi kích thước lớn. Khái niệm về sự hình thành ảnh này phần lớn được phát triển bởi Ernst Abbe, nhà lý thuyết quang học và kính hiển vi nổi tiếng người Đức ở thế kỷ 19. Theo Abbe (lý thuyết của ông vẫn được chấp nhận rộng rãi ở thời điểm hiện tại), các chi tiết của mẫu vật sẽ được giải quyết nếu vật kính thu được 2 bậc ánh sáng, chẳng hạn như bậc 0 của ánh sáng và ít nhất là bậc 1 của nhiễu xạ. Số bậc nhiễu xạ tiếp cận vật kính càng lớn thì ảnh sẽ thể hiện vật thể ban đầu càng chính xác. Hơn nữa, nếu sử dụng một môi trường có chiết suất cao hơn không khí (chẳng hạn như dầu ngâm) trong khoảng trống giữa thấu kính phía trước của vật kính và mặt trên của tiêu bản (như thể hiện đối với vật kính khô trong Hình 5(a)) , góc bậc nhiễu xạ giảm đi và các hình quạt của ánh sáng nhiễu xạ sẽ bị nén lại. Kết quả là, vật kính ngâm trong dầu có thể thu được nhiều bậc nhiễu xạ hơn và mang lại độ phân giải tốt hơn vật kính khô (Hình 5(b)). Hơn nữa, vì ánh sáng xanh bị nhiễu xạ ở góc nhỏ hơn ánh sáng xanh lục hoặc ánh sáng đỏ, nên một thấu kính có khẩu độ nhất định có thể thu được nhiều bậc ánh sáng hơn khi các bước sóng nằm trong vùng xanh lam của quang phổ ánh sáng khả kiến. Hai nguyên lý này giải thích phương trình Rayleigh cổ điển thường được dùng làm cơ sở để tính độ phân giải điểm-điểm trong kính hiển vi:

d (độ phân giải) = 1,22 • (λ/2NA) (1)

Trong đó d là khoảng không gian giữa hai hạt liền kề (vẫn cho phép các hạt được coi là riêng biệt), λ là bước sóng chiếu sáng và NA là khẩu độ số của vật kính. Giả sử rằng kính hiển vi cũng được trang bị một tụ quang có cùng khẩu độ như vật kính (nếu không có tụ quang, độ phân giải sẽ chỉ bằng một nửa dẫn đến các chi tiết được phân giải lớn gấp đôi). Số lượng bậc nhiễu xạ cao hơn được đưa vào vật kính càng lớn thì các chi tiết của mẫu vật có thể được phân tách hoặc phân giải rõ ràng càng nhỏ. Ở đây là giá trị của việc sử dụng vật kính có khẩu độ số cao để kiểm tra các chi tiết nhỏ nhất có thể có trong các mẫu vật khác nhau. Tương tự như vậy, bước sóng của ánh sáng khả kiến ​​được sử dụng càng ngắn thì độ phân giải càng tốt. Những ý tưởng này giải thích tại sao thấu kính tiêu sắc, khẩu độ số cao có thể tách các chi tiết cực nhỏ trong ánh sáng xanh. Đặt màng mờ ở phía sau vật kính sẽ chặn các trật tự nhiễu xạ ngoài cùng. Điều này hoặc làm giảm độ phân giải của các đường cách tử hoặc bất kỳ chi tiết mẫu nào khác hoặc phá hủy hoàn toàn độ phân giải khiến mẫu không thể nhìn thấy được. Do đó, người ta thường không đóng màng chắn khẩu độ tụ quang xuống dưới hai phần ba khẩu độ đề xuất của vật kính.

Việc vật kính không thể nắm bắt được nhiều hơn một trong các bậc nhiễu xạ sẽ dẫn đến hình ảnh không được phân giải. Trong một mẫu vật có độ chi tiết rất nhỏ, các quạt nhiễu xạ được trải ra ở một góc rất lớn, đòi hỏi vật kính có khẩu độ số cao để thu được chúng. Tương tự như vậy, do quạt nhiễu xạ được nén trong dầu ngâm hoặc trong nước nên vật kính được thiết kế cho mục đích sử dụng đó có thể cho độ phân giải tốt hơn vật kính khô. Nếu các lệnh nhiễu xạ thay thế bị chặn (vẫn giả sử cách tử là mẫu của chúng ta), số lượng vạch trong cách tử sẽ xuất hiện gấp đôi (độ phân giải giả). Lưu ý quan trọng là các thao tác được thực hiện ở phía sau vật kính thực sự quyết định hình ảnh cuối cùng được tạo ra. Đối với các chi tiết nhỏ trong mẫu vật (ngược lại với cách tử đường), vật kính chiếu ánh sáng trực tiếp và nhiễu xạ lên mặt phẳng ảnh của màng thị kính dưới dạng các mẫu nhiễu xạ tròn nhỏ được gọi là đĩa Airy (minh họa trong Hình 6). Vật kính có khẩu độ số cao thu được nhiều bậc nhiễu xạ hơn và tạo ra các đĩa có kích thước nhỏ hơn so với vật kính có khẩu độ số thấp. Trong Hình 6, kích thước đĩa Airy được hiển thị giảm dần từ Hình 6(a) đến Hình 6(c). Kích thước đĩa lớn hơn trong Hình 6(a) và (b) được tạo ra bởi vật kính có khẩu độ số thấp hơn, trong khi đĩa Airy rất sắc nét trong Hình 6(c) được tạo ra bởi vật kính có khẩu độ số rất cao.

Hình ảnh thu được ở cấp độ màng chắn của thị kính được coi là vùng sáng và tối của mẫu vật. Khi hai đĩa ở gần nhau đến mức các điểm sáng ở trung tâm của chúng chồng lên nhau đáng kể, thì hai chi tiết được biểu thị bằng các đĩa chồng lên nhau này không được phân giải hoặc tách rời và do đó xuất hiện dưới dạng một (Hình 6(e)). Ngược lại, các đĩa Airy được hiển thị trong Hình 6(d) chỉ cách nhau đủ xa để có thể giải quyết được. Nguyên tắc cơ bản cần nhớ là sự kết hợp giữa ánh sáng trực tiếp và ánh sáng nhiễu xạ (hoặc sự điều khiển ánh sáng trực tiếp hoặc nhiễu xạ) là cực kỳ quan trọng trong việc hình thành hình ảnh. Các vị trí chính cho thao tác như vậy là mặt phẳng tiêu cự phía sau của vật kính và mặt phẳng tiêu cự phía trước của tụ quang. Nguyên tắc này là nền tảng cho hầu hết các phương pháp cải thiện độ tương phản trong kính hiển vi quang học. Quan trọng hơn, nó có ý nghĩa đặc biệt ở độ phóng đại cao của các chi tiết nhỏ có kích thước gần bằng bước sóng ánh sáng. Ernst Abbe là người tiên phong trong việc phát triển những khái niệm này để giải thích sự hình thành hình ảnh của các mẫu có biên độ hoặc hấp thụ ánh sáng.

Nguồn: