Chất nhầy (Mucins)

Mucicarmine là một trong những kỹ thuật lâu đời nhất để xác định chất nhầy. Mặc dù không được sử dụng phổ biến như trước đây nhưng mucicarmine vẫn là một kỹ thuật có giá trị để đánh giá các chất nhầy axit, đặc biệt là các chất nhầy của đường tiêu hóa. Ngoài ra, kỹ thuật này còn hữu ích trong việc nhuộm vỏ nang của nấm Cryptococcus neoformans.

Phân tử thuốc nhuộm hoạt tính được tìm thấy trong mucicarmine là một phức hợp chelate được hình thành giữa các ion nhôm cation và axit carminic. Axit carminic là một phân tử thuốc nhuộm tự nhiên được phân lập từ cơ thể khô của côn trùng Coccus cacti cái. Các cation nhôm mang lại điện tích dương tổng thể cho phức hợp carmine. Mặc dù các cơ chế chính xác mà phức hợp này nhuộm có chọn lọc các chất nhầy vẫn chưa xác định, nhưng có thể cho thấy rằng đó là do lực hút tĩnh điện đối với các nhóm anion của chất nhầy axit. Định nghĩa này là từ các quan sát cho thấy rằng các vị trí mô chứa nhiều chất nhầy trung tính có ít hoặc không bị nhuộm màu trong khi các vị trí của đường tiêu hóa được biết là có chứa chất nhầy axit thường được nhuộm bằng mucicarmine.

Nhuộm xanh Alcian

Nhuộm xanh Alcian là một phân tử phthalocyanine cấu trúc phẳng với một nguyên tử đồng ở trung tâm. Phân tử này cũng chứa bốn nhóm isothiouronium cơ bản mang điện tích dương. Điện tích dương được truyền bởi các nhóm này dẫn đến sự thu hút các phân tử thuốc nhuộm xanh Alcian đến các vị trí anion trong phân tử chất nhầy. Giống như mucicarmine, màu xanh Alcian không làm ố các chất nhầy trung tính.

Thay đổi độ pH của thuốc nhuộm xanh Alcian là một phương tiện hữu ích để xác định thêm đặc tính của các phân nhóm chất nhầy axit có trong mẫu mô. Tất cả các chất nhầy có tính axit dù được carboxyl hóa hay sunfat hóa sẽ ion hóa ở độ pH 2,5 để tạo ra các nhóm anion (COO, SO₃). Do đó, màu xanh Alcian tiêu chuẩn – pH 2,5 nhuộm tất cả các chất nhầy có tính axit (Hình 3). Ngược lại, chất nhầy có chứa chủ yếu là carbohydrate carboxyl hóa sẽ nhuộm xanh Alcian – pH 2.5 nhưng không có màu xanh Alcian ở pH 1.0. Các nhóm cacboxyl không bị ion hóa ở độ pH thấp hơn này và kết quả là chất nhầy sẽ có đặc tính trung tính. Các nhóm sulphonic có tính axit cao hơn có khả năng ion hóa ở độ pH=1, thích hợp để tiến hành nhuộm màu.

Nhuộm sắt Colloid 

Kỹ thuật nhuộm sắt Colloid dựa trên sự hút các ion sắt tích điện dương (cation sắt) đối với các đầu nhóm carboxylate và sunfat tích điện âm trong chất nhầy có tính axit. Các ion sắt liên kết sẽ được xác định khi xử lý với kali ferrocyanide để tạo thành các cặn màu xanh sáng của ferrocyanide sắt hoặc xanh Phổ. Mặc dù kỹ thuật nhuộm sắt Colloid là một phương pháp cực kỳ nhạy để xác định chất nhầy axit nhưng nó không được sử dụng thường xuyên như nhuộm xanh Alcian. Tuy nhiên, giống như nhuộm xanh Alcian, kỹ thuật nhuộm sắt Colloid có thể được sử dụng kết hợp với axit periodic còn được gọi là kỹ thuật Schiff.

Nhuộm Axit periodic – Schiff (PAS)

Kỹ thuật PAS là kỹ thuật linh hoạt và được sử dụng rộng rãi nhất để biểu hiện glycoprotein, carbohydrate và chất nhầy. Không giống như các kỹ thuật khác đã mô tả, kỹ thuật PAS cũng sử dụng để nhận biết các chất nhầy trung tính. Khả năng phản ứng của kỹ thuật PAS không dựa trên sự hiện diện của các nhóm axit giữa các polysacarit mà thay vào đó dựa trên cấu trúc của các đơn vị monosacarit.

Kỹ thuật PAS dựa trên khả năng phản ứng của các nhóm aldehyd tự do trong các đơn vị monosacarit với thuốc thử Schiff để tạo thành sản phẩm cuối cùng có màu đỏ. Phản ứng ban đầu trong kỹ thuật PAS là quá trình oxy hóa các nhóm hydroxyl (OH) gắn với các nguyên tử cacbon liền kề. Các nhóm này được đề cập như là glycol 1, 2. Quá trình oxy hóa các glycol này dẫn đến sự hình thành các nhóm aldehyd phản ứng Schiff. Trong hầu hết các quy trình, dung dịch axit tuần hoàn 0,5% đến 1,0% được sử dụng làm chất oxy hóa.

Cường độ nhuộm màu sau phản ứng với thuốc thử Schiff tỷ lệ thuận với nồng độ của 1-2 nhóm glycol phản ứng trong mô. Kỹ thuật PAS cũng là phương pháp có độ nhạy cao trong việc xác định chất nhầy trung tính cũng như chất nhầy axit có chứa một lượng đáng kể axit sialic. Ngoài chất nhầy, kỹ thuật PAS cũng được sử dụng rộng rãi để phát hiện glycogen và các loại glycoprotein khác nhau. Kỹ thuật PAS đặc biệt có giá trị trong việc quan sát màng đáy dựa trên sự xuất hiện của phản ứng Schiff để xác định glycoprotein trong các cấu trúc này.

Nhuộm xanh Alcian / PAS

Sự kết hợp giữa kỹ thuật nhuộm xanh Alcian và PAS có thể được sử dụng như một phương pháp để phân biệt chất nhầy trung tính với chất nhầy axit. Trong hầu hết các quy trình, các phần được nhuộm bằng phương pháp nhuộm xanh Alcian tiêu chuẩn (pH 2,5), sau đó là kỹ thuật PAS. Nhuộm xanh Alcian ở độ pH 2,5 sẽ nhuộm tất cả các chất nhầy axit có màu xanh đậm nhưng sẽ không tạo màu cho các chất nhầy trung tính. Việc áp dụng kỹ thuật PAS tiếp theo sẽ làm cho chất nhầy trung tính có màu đỏ. Các mô hoặc tế bào chứa cả chất nhầy trung tính và axit có thể có màu xanh đậm hoặc tím (Hình 4). Kết hợp nhuộm xanh Alcian và PAS rất hữu ích vì một số lý do. Những thay đổi trong sự phân bố hoặc kiểu biểu hiện của chất nhầy trung tính và axit là dấu hiệu của một số tình trạng bệnh lý. Ngoài ra, kết hợp kỹ thuật nhuộm xanh Alcian /PAS sẽ là phương pháp có độ nhạy cao và toàn diện nhất để kiểm tra chất nhầy và tất cả chất nhầy sẽ phản ứng với bất kể tính chất điện tích.

Hình minh họa