Nguồn sáng kính hiển vi – Đèn hồ quang thủy ngân áp suất cao sáng hơn từ 10 đến 100 lần so với đèn sợi đốt (chẳng hạn như đèn vonfram-halogen) và có thể cung cấp ánh sáng mạnh trên các dải bước sóng đã chọn trong toàn bộ vùng quang phổ khả kiến khi kết hợp với các bộ lọc thích hợp. Những nguồn chiếu sáng này có độ tin cậy cao, tạo ra mật độ thông lượng rất cao và đã được sử dụng rộng rãi trong kính hiển vi huỳnh quang. Được gọi là đèn HBO ( H là Hg hoặc thủy ngân; B là ký hiệu cho độ chói; O là làm mát không cưỡng bức), một số lượng lớn đầu dò huỳnh quang đã được phát triển cho nguồn sáng phổ biến này. Lần đầu tiên được giới thiệu vào những năm 1930, hàng nghìn kính hiển vi được trang bị đèn hồ quang thủy ngân đã được các nhà sản xuất bán ra trong vài thập kỷ qua. Tuy nhiên, so với đèn sợi đốt truyền thống, độ sáng tăng đáng kể mà đèn hồ quang thủy ngân mang lại đi kèm với sự bất tiện trong việc căn chỉnh cơ học quan trọng, tuổi thọ ngắn hơn, giảm tính đồng nhất về thời gian và không gian, yêu cầu về nhà đèn và nguồn điện chuyên dụng, nguy cơ cháy nổ cao hơn. Tuy nhiên, đèn hồ quang thủy ngân vẫn là vật dụng chính trong kính hiển vi huỳnh quang và vẫn được coi là một trong những nguồn chiếu sáng tốt nhất, đặc biệt là đối với độ phong phú thấp hoặc huỳnh quang yếu có cực đại kích thích trùng với quang phổ. dòng phát ra từ plasma thủy ngân nóng.
Đèn phóng điện hồ quang thủy ngân tạo ra mức độ chói và độ bức xạ cao nhất so với bất kỳ nguồn sáng hoạt động liên tục nào dành cho kính hiển vi quang học và rất gần với mô hình lý tưởng cho nguồn sáng điểm. Tuy nhiên, đèn thủy ngân có cường độ dao động lớn hơn đáng kể so với đèn sợi đốt, điốt phát sáng (đèn LED) hoặc nguồn laser, chủ yếu là do plasma khí vốn không ổn định và bị ảnh hưởng bởi cả từ trường và sự ăn mòn của các điện cực. Độ ổn định của đèn trong thời gian ngắn bị ảnh hưởng bởi ba hiện tượng của hồ quang plasma được tạo ra giữa các điện cực vonfram. Arc wander xảy ra khi điểm gắn của hồ quang trên bề mặt đầu cực âm hình nón đi qua điện cực theo hình tròn, thường cần vài giây để quay hết một vòng tròn. Đèn rọi đề cập đến sự thay đổi độ sáng nhất thời khi hồ quang di chuyển đến vùng mới của cực âm với chất lượng phát xạ cao hơn điểm đính kèm trước đó. Cuối cùng, dòng đối lưu trong hơi thủy ngân phát sinh từ sự chênh lệch nhiệt độ giữa plasma và vỏ tạo ra hiện tượng arc flutter, được biểu hiện bằng sự dịch chuyển nhanh chóng sang một bên của cột hồ quang.
Ngoài ra, chúng còn có tuổi thọ giới hạn khoảng 200 giờ và có sự thay đổi đáng kể về độ ổn định không gian và thời gian. Bởi vì hình ảnh cung được tập trung vào khẩu độ phía sau của vật kính (trong chiếu sáng Köhler), khía cạnh quan trọng nhất của đèn thủy ngân là cường độ của hình ảnh quang học. Điều đáng ngạc nhiên là hình ảnh này có mức công suất cao hơn tạo ra nhiều ánh sáng hơn nhưng kích thước cung thực tế lại lớn hơn và hình ảnh tương ứng của nó phải được giảm xuống dưới kích thước thực tế để phù hợp với khẩu độ vật kính phía sau. Việc giảm thiểu kích thước vòng quang dẫn đến giảm cường độ hình ảnh và vì lý do này, đèn có vòng quang nhỏ hơn thực sự tạo ra ánh sáng mạnh hơn. Độ sáng trong trường nhìn của kính hiển vi được phân bố đồng đều nhất khi hình ảnh sắc nét của cung được tập trung ở khẩu độ phía sau vật kính. Mặc dù hình ảnh vòng quang được xác định và tập trung cao dẫn đến các vùng của khẩu độ có sự dao động nhỏ về cường độ ánh sáng, nhưng hiệu ứng thực sự là khả năng hạn chế một số góc chiếu sáng tới mẫu vật. Tuy nhiên, do sự kích thích huỳnh quang không nhạy với góc chiếu sáng nên tính không đồng nhất này thường không làm giảm chất lượng hình ảnh. Ngược lại, khi hình ảnh cung không được tập trung chính xác vào khẩu độ vật kính, sự dao động cường độ thường được quan sát thấy ở các vùng khác nhau của mẫu vật.
Bảng 1: Công suất đèn hồ quang thủy ngân (HBO)
Trình bày trong Bảng 1 là các giá trị công suất quang đầu ra của nguồn sáng HBO 100 watt điển hình sau khi đi qua dãy quang học của kính hiển vi và các bộ lọc huỳnh quang được chọn. Công suất (tính bằng miliwatt/cm2) được đo tại mặt phẳng tiêu điểm của vật kính (40x fluorite dry, khẩu độ số = 0,85) bằng máy đo phóng xạ dựa trên photodiode. Một chiếc gương có độ phản xạ lớn hơn 95% từ 350 đến 800 nanomet hoặc bộ lọc huỳnh quang tiêu chuẩn được sử dụng để chiếu ánh sáng qua vật kính và vào cảm biến đo bức xạ. Sự thất thoát ánh sáng trong hệ thống chiếu sáng kính hiển vi có thể thay đổi trong khoảng từ 50 đến 99% công suất đầu vào, tùy thuộc vào cơ chế ghép nguồn sáng và số lượng bộ lọc, gương, lăng kính và thấu kính trong dãy quang học. Ví dụ, đối với kính hiển vi đảo ngược cấp độ nghiên cứu điển hình được ghép nối với đèn HBO ở cổng vào của đèn chiếu sáng epi, có ít hơn 50% ánh sáng thoát ra khỏi hệ thống thấu kính thu có sẵn để kích thích các tế bào huỳnh quang đặt ở khoảng tiêu cự vật kính.
Tuổi thọ định mức của đèn hồ quang thủy ngân phụ thuộc vào cách chúng được sử dụng và giới hạn 200 giờ thông thường có thể bị ảnh hưởng do số lần khởi động quá nhiều. Hoạt động bình thường yêu cầu thời gian cháy tối thiểu là 30 phút và tổng số lần “đốt” không vượt quá một nửa tổng số giờ định mức (tối đa khoảng 100). Do đó, một đèn HBO 100 thông thường không được “đốt” quá 100 lần và cháy trung bình hai giờ cho mỗi lần. Khi đèn hồ quang thủy ngân lão hóa, chúng sẽ đen đi và ngày càng khó “đốt” hơn do sự thoái hóa của cực âm và cực dương. Hơn nữa, trong quá trình sử dụng, việc căn chỉnh đèn có thể bị lệch do đó hình ảnh hồ quang có thể dần dần mất nét ở khẩu độ phía sau vật kính, đòi hỏi phải điều chỉnh nhiều lần cơ chế căn chỉnh. Nói chung, điểm cuối của đèn hồ quang thủy ngân là điểm mà tại đó lượng tia cực tím phát ra giảm khoảng 25% và độ không ổn định của hồ quang tăng hơn 10% hoặc nếu đèn không còn cháy nữa. Khi đèn đã đạt hoặc vượt quá tuổi thọ sử dụng vừa phải thì nên thay thế.
Cấu hình phát xạ của đèn hồ quang thủy ngân khác với đèn sợi đốt ở chỗ một số vạch phát xạ nổi bật xuất hiện ở các vùng quang phổ cực tím, xanh lam, xanh lục và vàng, sáng hơn đáng kể (lên tới 100 lần) so với nền liên tục (xem Hình 1). Khoảng 45% công suất bức xạ từ đèn thủy ngân HBO 100 watt tiêu chuẩn nằm trong khoảng bước sóng của kính hiển vi huỳnh quang từ 350 đến 700 nanomet. Ngoài ra, phần lớn năng lượng ánh sáng tử ngoại và khả kiến không được phân bố đều trên quang phổ mà tập trung ở các vạch phổ ở 365 nanomet (gần tia cực tím; 10,7%), 405 nanomet (tím; 4%), 436 nanomet (sâu). xanh lam; 12,6%), 546 nanomet (xanh-vàng; 7,1%) và 579 (dải đôi màu vàng; 7,9%). Đèn hồ quang thủy ngân cũng có một số lượng đáng kể các vạch quang phổ ở vùng tử ngoại trong khoảng từ 250 đến 350 nanomet và một số vạch quang phổ nhỏ hơn ở bước sóng hồng ngoại vượt quá 1000 nanomet. Ngược lại, vùng phát xạ quang phổ của đèn thủy ngân trong khoảng từ 600 đến 1000 nanomet tương đối liên tục và không sáng hơn so với đèn hồ quang xenon, vốn trải rộng trên phạm vi quang phổ rộng chỉ với một vài vạch quang phổ ở vùng xanh lam và hồng ngoại. Đường màu xanh lục-vàng 546 nanomet của đèn hồ quang thủy ngân đã trở thành một tham chiếu phổ biến để hiệu chỉnh bước sóng trong nhiều loại thiết bị quang học và được các nhà khoa học trong cộng đồng sinh học yêu thích để kiểm tra tế bào sống.
Bảng 2: Các chất huỳnh quang được lựa chọn để kích thích hồ quang thủy ngân
Một nỗ lực đáng kể đã được dành cho việc phát triển các chất huỳnh quang chuyên dụng có cực đại hấp thụ nằm gần các vạch quang phổ thủy ngân nổi bật (xem Bảng 2). Các đầu dò huỳnh quang cổ điển DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) và rhodamine lần lượt hấp thụ hiệu quả các vạch thủy ngân có bước sóng 365 và 546 nanomet, tuy nhiên mức hấp thụ tối đa của fluorescein (có lẽ là một trong những chất fluorophores được sử dụng rộng rãi nhất) nằm ở vùng từ 450 đến 500 nanomet, không có vạch thủy ngân nổi bật (Hình 1). Các chất fluorophores tổng hợp mới hơn, bao gồm dòng MitoTrackers, Cyanine (Cy) và thuốc nhuộm Alexa Fluor đã được thiết kế đặc biệt để phù hợp với các vạch quang phổ thủy ngân. Ví dụ: độ hấp thụ tối đa của MitoTracker Red là 579 nanomet gần như khớp chính xác với vạch thủy ngân tương ứng, trong khi Cy3 (tối đa là 548 nanomet) hấp thụ hiệu quả vạch thủy ngân 546. Một số thuốc nhuộm Alexa Fluor được đặt tên theo đặc tính hấp thụ thủy ngân tương đương của chúng: Alexa Fluor 350 (thủy ngân-365), Alexa Fluor 405 (thủy ngân-405), Alexa Fluor 430 (thủy ngân-436) và Alexa Fluor 546 (thủy ngân-546). Nói chung, khi kích thích các chất huỳnh quang bằng nguồn chiếu sáng hồ quang thủy ngân, nên chọn trong số các chất huỳnh quang có sẵn rộng rãi phù hợp chặt chẽ với các vạch quang phổ. Cần lưu ý rằng đèn hồ quang thủy ngân không phải là nguồn sáng thích hợp cho một số loại thuốc nhuộm đo tỷ lệ, chẳng hạn như Fura-2 và Indo-1, trong đó việc so sánh tín hiệu ở hai bước sóng kích thích bị ảnh hưởng do thực tế là một trong các bước sóng trùng với đỉnh thủy ngân ở mức độ lớn hơn nhiều so với đỉnh kia. Ngoài ra, sự phát xạ tương đối yếu của đèn thủy ngân ở vùng 450 đến 540 nanomet khiến các nguồn chiếu sáng này ít hữu ích hơn đối với nhiều loại thuốc nhuộm phổ biến hấp thụ mạnh ở vùng xanh lam, bao gồm fluorescein, Alexa Fluor 488, Cy2 và nhiều loại thuốc nhuộm protein huỳnh quang xanh.
Hệ thống đèn hồ quang thủy ngân của kính hiển vi
Mật độ thông lượng cực cao (độ sáng) do đèn hồ quang thủy ngân tạo ra đạt được bằng cách tạo ra hồ quang trong một vùng giới hạn giữa hai điện cực đặt gần nhau trong môi trường khí áp suất cao. Khí và các điện cực được chứa trong một vỏ bọc (hoặc bóng đèn) hình elip, trong suốt về mặt quang học được làm bằng silica nung chảy (xem Hình 2). Các điện cực được chế tạo từ hợp kim vonfram có nhiệt độ nóng chảy trên 3400°C, một trong số ít vật liệu có khả năng chịu được nhiệt độ plasma hồ quang cao. Ngoài ra, vonfram có áp suất hơi thấp nhất trong tất cả các kim loại, một đặc điểm khác khi xem xét yêu cầu nhiệt độ cao trong quá trình vận hành. Đèn hồ quang thủy ngân chứa đầy khí trơ (hiếm) như argon hoặc xenon dưới áp suất thấp và một lượng thủy ngân kim loại được đo cẩn thận. Liều lượng thủy ngân được tính toán sao cho đèn tạo ra áp suất bên trong lên tới 75 atm (1.087 pound mỗi inch vuông) trong quá trình hoạt động.
Vỏ đèn hồ quang thủy ngân được sản xuất bằng thủy tinh thạch anh hoặc silic nung chảy tinh khiết, không thấm đối với hầu hết các loại khí ở nhiệt độ và áp suất cao, do đó lý tưởng để chứa plasma nóng. Hơn nữa, hệ số giãn nở thấp và độ bền cơ học cao của những loại kính này giúp chúng có kích thước ổn định và có khả năng hoạt động trong các điều kiện vận hành đèn khắc nghiệt. Vỏ bọc được sản xuất từ ống chất lượng cao để tránh hỏng đèn do các điểm ứng suất cục bộ phát sinh từ túi khí và tạp chất. Thạch anh truyền ánh sáng với hiệu suất cao từ khoảng 180 nanomet đến 4 micromet, nhưng đèn được thiết kế cho kính hiển vi quang học được chế tạo bằng thạch anh pha tạp để hấp thụ bước sóng cực tím ngắn hơn và giảm thiểu việc tạo ra ozone. Hầu hết các hợp kim thủy tinh được sử dụng để chế tạo đèn hồ quang thủy ngân đều có hàm lượng hydroxyl (OH) rất ít, do đó loại bỏ sự hấp thụ hồng ngoại ở bước sóng 2,7 micromet và giảm tải nhiệt trên vỏ bọc.
Một trong những tính năng quan trọng nhất của cấu tạo đèn hồ quang là lớp phủ từ kim loại đến thạch anh cần thiết để cách ly các điện cực với không khí xung quanh và để hỗ trợ cơ học cho đèn. Lớp này phải không thấm khí đồng thời có thể chịu được dòng điện hàng trăm ampe, nhiệt độ trong khoảng từ 200° đến 300° C và áp suất từ 30 atm trở lên. Kỹ thuật phổ biến nhất để hàn kín các điện cực bao gồm việc bọc các dải ruy băng mỏng bằng lá molypden theo cấu hình song song, đồng tâm được kẹp giữa một thanh thạch anh và ống bọc đồng trục, sau đó được bao phủ bởi một lớp keo dính chịu nhiệt. Chiều rộng cực mỏng và các cạnh của giấy bạc cho phép bảo vệ hiệu quả ống thạch anh bất kể sự khác nhau về hệ số giãn nở nhiệt. Các vòng đệm đèn được đậy bằng các ống nối hoặc đế có tác dụng vừa là kết nối điện chắc chắn vừa là cơ chế cơ học chính xác để định vị nguồn điểm trong hệ thống quang học của kính hiển vi. Thiết kế của Ferrule khác nhau, nhưng hầu hết đều có chốt định vị có ren hoặc trơn và một số có cáp nối đèn với thiết bị đầu cuối trong đèn. Các ống nối được thiết kế để hỗ trợ làm mát đèn và thường được chế tạo từ đồng thau mạ niken.
Hệ thống đèn và nguồn điện cung cấp
Trong cấu hình kính hiển vi quang học điển hình, đèn thủy ngân được đặt bên trong một đèn chiếu sáng chuyên dụng bao gồm vỏ đèn chứa đèn, gương phản xạ lõm, hệ thống thấu kính thu có thể điều chỉnh để tập trung đầu ra của đèn, ổ cắm điện để cố định và căn chỉnh ánh sáng và nguồn điện bên ngoài (Hình 3). Tùy thuộc vào thiết kế, đèn hồ quang thủy ngân cũng có thể chứa các bộ lọc để chặn bước sóng cực tím và gương nóng để chặn nhiệt đi vào hệ thống quang học của kính hiển vi. Nhiều đèn cũng có bộ tản nhiệt bên ngoài để tản nhiệt và các lỗ thông hơi cho phép tản không khí nóng hơn, trong khi một số khác cũng có một cánh tản nhiệt lớn gắn vào chính đèn (Hình 3). Ngoài ra, đèn phải có một núm điều chỉnh vị trí thấu kính thu và các vật dụng để căn chỉnh đèn và gương phản xạ.
Đèn hồ quang thủy ngân yêu cầu nguồn điện một chiều (DC) được thiết kế đặc biệt để đáp ứng các yêu cầu về đánh lửa và vận hành cho từng thiết kế đèn. Một nguồn điện thông thường phải cung cấp xung khởi động lên tới 50 kilovolt để ion hóa khí trong khe hở hồ quang, cũng như điện áp mạch hở gấp ba đến năm lần điện áp hoạt động định mức của đèn để làm nóng cực âm đến nhiệt độ phát xạ nhiệt. Các yêu cầu bổ sung bao gồm mức dòng điện khởi động tối đa để ngăn ngừa sốc nhiệt quá mức trong quá trình “đốt cháy”. Dòng điện khởi động có thể lớn hơn nhiều bậc so với giá trị trạng thái ổn định của mạch đèn và thường là nguyên nhân gây ra các lỗi. Bộ nguồn của đèn cũng phải hạn chế độ gợn dòng điện ở mức dưới 10% (cực đại đến cực đại) để đảm bảo tuổi thọ bóng đèn dài và độ ổn định của ánh sáng. Cuối cùng, bộ nguồn phải có khả năng điều chỉnh dòng điện đặt vào trong phạm vi rộng vì điện áp có thể tăng đáng kể trong thời gian đèn khởi động.
Nguồn điện cho đèn hồ quang thủy ngân HBO 100 dùng trong kính hiển vi quang học thường được trang bị một số tính năng cho phép người vận hành theo dõi các điều kiện hoạt động và tuổi thọ. Bao gồm đèn báo “đốt cháy”, đèn báo hiệu khi máy biến áp đã đạt đến nhiệt độ bên trong trong phạm vi cho phép, đèn an toàn để cảnh báo người vận hành rằng mạch an toàn của vỏ đèn đã đóng và đèn điện áp được kích hoạt khi máy biến áp hoạt động trong phạm vi điện áp cho phép. Tất cả các bộ nguồn DC của đèn thủy ngân thương mại cũng có màn hình hiển thị có thể cài đặt lại tổng thời gian (tính bằng giờ) mà đèn đã hoạt động.
Nguồn cấp dùng cho đèn hồ quang cần được kiểm tra và bảo trì liên tục. Cụm ổ cắm đèn và dây nguồn phải được kiểm tra định kỳ xem có bề mặt kim loại bị oxy hóa (điện cực ổ cắm) và tính toàn vẹn của dây không. Các điện cực ổ cắm dễ bị oxy hóa và cần được chải nhẹ bằng vải nhám (hoặc giấy nhám) mỗi khi thay đèn để đảm bảo tiếp xúc điện tốt. Bóng đèn, gương phản chiếu phía sau và thấu kính thu phía trước cần được kiểm tra và làm sạch nếu cần thiết để loại bỏ bụi bẩn, xơ vải và dầu bám trên dấu vân tay. Mỗi lần thay đèn, cần kiểm tra cụm thấu kính thu và cơ cấu định vị gương phản xạ để đảm bảo hoạt động bình thường. Các núm hoặc vít điều chỉnh đèn chiếu sáng phải được điều chỉnh trong khi kiểm tra chuyển động của bộ thu và gương phản xạ để đảm bảo chúng di chuyển theo cách mong muốn. Đường dây điện cao thế nối nguồn điện và đèn không được uốn cong vì thao tác này có thể làm căng hoặc lỏng các dây bên trong và dẫn đến trục trặc.
Nguồn:
Công ty Minh Khang là nhà phân phối độc quyền thị trường miền Nam phân khúc kính hiển vi hãng Carl ZEISS.