Giới thiệu
Trong khi hợp tác với United States Navy vào cuối những năm 1940, Wallace H. Coulter đã phát triển một phương pháp định cỡ và đếm tế bào. Phương pháp này chủ yếu được phát triển để đếm tế bào máu một cách chính xác và nhanh chóng. Sự thừa nhận trong lĩnh vực huyết học của nó thể hiện rõ ở chỗ hiện nay hơn 98% máy đếm tế bào tự động kết hợp Nguyên lý Coulter. Trong 20 năm qua, phương pháp này cũng đã được sử dụng để mô tả vật liệu sinh học và công nghiệp khác nhau. Vi khuẩn, tế bào nấm men, thuốc, sắc tố, mực in, thực phẩm, chất mài mòn, chất nổ, đất sét, khoáng chất, kim loại và nhiều loại khác đều đã được phân tích theo Nguyên lý Coulter. Phương pháp còn được sử dụng để phân tích bất kỳ vật liệu dạng hạt lơ lửng trong chất điện phân. Phương pháp này được mô tả trong Tiêu chuẩn quốc tế ISO 13319 và là chủ đề của một số tiêu chuẩn ASTM. Hơn 7000 tài liệu tham chiếu về việc sử dụng các mô hình BỘ ĐẾM COULTER đã được ghi chép lại.
Nguyên lý Coulter
Định cỡ và đếm tế bào
Nguyên lý Coulter dựa trên việc phát hiện và đo lường sự thay đổi trong điện trở điện do một hạt hoặc tế bào lơ lửng trong một chất lỏng dẫn điện (dung môi) tạo ra khi nó đi qua một lỗ lọc. Khi các hạt hoặc tế bào lơ lửng trong một chất lỏng dẫn điện, chúng hoạt động như những chất cách điện riêng. Khi một hỗn dịch loãng của các hạt được hút qua một lỗ lọc trên hình trụ, sự đi qua của mỗi tế bào riêng lẻ sẽ tạm thời điều chỉnh trở kháng của đường dẫn điện giữa hai điện cực chìm nằm ở hai bên lỗ lọc, tạo ra một xung điện. Hình 1 minh họa sự di chuyển của một tế bào qua lỗ lọc.
Số lượng xung điện thể hiện số lượng tế bào, trong khi biên độ của xung điện tạo ra phụ thuộc vào thể tích của tế bào. Điện trở hiệu dụng giữa các điện cực là do điện trở của chất lỏng dẫn điện trong ranh giới của lỗ lọc. Sự có mặt của một tế bào trong lỗ lọc làm tăng điện trở của mặt phẳng dẫn điện với một mức độ phụ thuộc vào thể tích của tế bào. Phân tích lý thuyết và thực nghiệm về hành vi của các tế bào trong lỗ lọc cho thấy rằng chiều cao của xung điện do tế bào tạo ra là đặc điểm tỷ lệ chặt chẽ nhất với thể tích của tế bào. Phương pháp này cho phép đếm chọn lọc các tế bào trong các dải phân bố kích thước rất hẹp thông qua việc lựa chọn điện tử của các xung mà chúng tạo ra.
Nguyên lý Coulter áp dụng trong thiết bị Multisizer 4e
Hình 1. Nguyên lý đếm và phân loại của Coulter.
Tầm quan trọng của phân tích kích thước tế bào
Nghiên cứu về sự phân bố kích thước tế bào có thể mang lại nhiều thông tin có giá trị liên quan đến: tác động của thuốc đến sự phát triển của tế bào nuôi cấy mô, tốc độ phát triển của vi khuẩn, kích thước tế bào thay đổi như thế nào theo tuổi tác và nhiều chủ đề khác có liên quan đến y sinh học.
Thể tích tế bào thay đổi trong nhiều quá trình sinh học, chẳng hạn như:
- Sự phát triển của tế bào và chu kỳ tế bào
- Tế bào chết
- Điều chỉnh thích nghi với sự thay đổi áp suất thẩm thấu
- Sinh bệnh học
- Nội bào và thực bào
Ví dụ, các tế bào tăng sinh trong nuôi cấy có xu hướng tăng gấp đôi thể tích trước mỗi lần phân chia, nhưng người ta không biết tốc độ tăng trưởng và phân chia được phối hợp như thế nào để đảm bảo duy trì kích thước tế bào. Khả năng đo lường sự thay đổi thể tích tế bào có thể chứng minh là một công cụ quan trọng để hiểu và kiểm soát sự tăng trưởng và chu kỳ trong tế bào.
Ngoài ra, việc duy trì số lượng tế bào đầy đủ đòi hỏi sự cân bằng giữa sự tăng sinh tế bào và chết đi của tế bào. Sự cân bằng này cho phép thích nghi tối ưu với các nhu cầu chức năng thay đổi. Sự chết tế bào có thể được thực hiện thông qua ít nhất hai cơ chế riêng biệt, hoại tử (necrosis) và chết tế bào theo chương trình (apoptosis). Necrosis là một cơ chế bệnh sinh liên quan đến sự sưng tế bào, phá vỡ màng tế bào với sự giải phóng thành phần nội bào. Apoptosis là một cơ chế chết tế bào theo chương trình. Một trong những đặc điểm của apoptosis là sự co lại của tế bào. Các nhà khoa học cho rằng nhiều bệnh, đặc biệt là ung thư, có thể bắt nguồn từ sự rối loạn trong việc kiểm soát quá trình tăng sinh tế bào và chết tế bào theo chương trình. Khi sự cân bằng này bị phá vỡ, các tế bào có thể phát triển không kiểm soát, dẫn đến hình thành khối u và các bệnh khác.
Nguyên lý Coulter là một trong những kỹ thuật phổ biến nhất để phân tích kích thước tế bào. Trong hướng dẫn này, một số phương pháp sử dụng Nguyên lý Coulter được trình bày cùng với một số ví dụ điển hình.
Hướng dẫn đo lường cho tế bào sinh học
Dưới đây trình bày một số phép đo kích thước tế bào khác nhau cho nhiều loại tế bào khác nhau. Ghi chú chuẩn bị liên quan đến cả dung dịch đệm và pha loãng được cung cấp cho người sử dụng cùng với các đường biểu diễn phân bố kích thước. Như dữ liệu này cho thấy, Nguyên lý Coulter cung cấp độ nhạy, độ chính xác và tính linh hoạt cần thiết để nghiên cứu phân bố kích thước tế bào cho nhiều sinh vật có đặc điểm sinh học rất khác nhau.
Vi khuẩn
| Kích thước lỗ lọc (s) | Chất điện phân | Ghi chú chuẩn bị | Pha loãng |
| MS4e sử dụng 10 hoặc 20 µm | Isoton II
0,9% NaCl 2% NaCl Lọc lại hai lần qua màng lọc 0,22 µm |
Đối với các nghiên cứu về vi khuẩn, điều quan trọng là nền điện phân phải càng thấp càng tốt. Nếu tự sản xuất điện phân, trước khi lọc, phải thêm một lượng nhỏ chất kìm khuẩn phù hợp, chẳng hạn như natri azide 0,1%.
Nói chung, mức độ chấp nhận được của tín hiệu nền ở mức cài đặt thấp nhất có thể sử dụng của thiết bị nên khoảng 1 – 2% tổng số lượng tế bào |
1:10.000 trong chất điện phân |
Hình 2. Ví dụ về nuôi cấy tế bào S.aureus ở định dạng nồng độ (số lượng trên mL). Lưu ý kích thước tế bào trung bình là 0,991 micron
Hình 3. Ví dụ về nuôi cấy tế bào E.coli theo định dạng nồng độ (số lượng trên mL). Lưu ý kích thước tế bào trung bình là 1,059 micron.
Khuôn
| Kích thước lỗ lọc (s) | Chất điện phân | Ghi chú chuẩn bị | Pha loãng |
| MS4e sử dụng 20 µm
Z Series sử dụng 50 µm |
Isoton II
0,9% NaCl 2% NaCl Lọc qua màng lọc 0,22 µm |
Lọc chất điện phân qua màng lọc 0,22 µm | 1:400 trong chất điện phân |
Hình 4. Ví dụ về Aspergillus ở định dạng đếm tổng số tế bào. Lưu ý số lượng đếm cao 1 µm trở xuống có thể là do mảnh vụn dưới tế bào.
Hình 5. Hình ảnh phóng to của Aspergillus Hình 8 trong khoảng 1,6 – 5 micron.
Tế bào máu toàn phần
| Kích thước lỗ lọc (s) | Chất điện phân | Ghi chú chuẩn bị | Pha loãng |
| Multisizer sử dụng 70 µm
Z Series sử dụng 100 µm |
Isoton II | Lọc chất điện phân qua màng lọc 0,22 µm | 1:150.000 trong Isoton II |
Hình 6. Ví dụ về máu toàn phần từ Donor 1. Định dạng Nồng độ tế bào. Lưu ý hai đỉnh biểu thị các phân nhóm tế bào khác nhau trong toàn bộ máu.
Hình 7. Ví dụ về máu toàn phần của Donor 2.
Hình 8. Sự chồng chéo của Donor 1 và Donor 2.
Tế bào bạch cầu
| Kích thước lỗ lọc (s) | Chất điện phân | Ghi chú chuẩn bị | Pha loãng |
| Multisizer sử dụng 70 µm
Z Series sử dụng 100 µm |
Isoton II | Khi phân tích WBC trong toàn bộ máu, việc lựa chọn dung dịch ly giải thích hợp là rất quan trọng để có kết quả chính xác.
Trong ví dụ này, VersaLyse* được sử dụng làm tác nhân phân hủy. Quy trình:
* VersaLyse là thuốc thử ly giải của Beckman Coulter |
1:500 trong Isoton II |
Hình 9. Ví dụ về tế bào bạch cầu từ máu toàn phần đã bị phân hủy. Lưu ý đỉnh lớn khoảng 5 micron biểu thị tế bào hồng cầu đã biến mất trong mẫu đã xử lý này.
Hình 10. Chồng mẫu máu toàn phần với mẫu tế bào bạch cầu bị phân hủy.
Ty thể
| Kích thước lỗ lọc (s) | Chất điện phân | Ghi chú chuẩn bị | Pha loãng |
| Multisizer sử dụng 10 µm | Isoton II
Lọc chất điện phân qua bộ lọc embrane 0,22 µm |
Không cần pha loãng mẫu ty thể trước khi thêm vào dung dịch điện phân. Thể tích chuyển 10, 50 hoặc 100 µL mẫu ty thể vào accuvette chứa 20 mL Isoton II là đủ.
Vì đường kính ty thể rất nhỏ nên phải sử dụng lỗ lọc 10 um. Việc vệ sinh lỗ lọc kỹ lưỡng sau mỗi lần sử dụng là vô cùng quan trọng. Vệ sinh thường xuyên sẽ giúp lỗ lọc ít bị tắc nghẽn hơn. Ngâm lỗ lọc trong cốc nước thủy tinh trên bàn gia nhiệt là rất hữu ích. |
Không có |
| Hướng dẫn được cung cấp bởi: Preble, Janine M Khoa Phẫu thuật Tim mạch, Trung tâm Y tế Beth Israel Deaconess và Trường Y Harvard, Boston, Massachusetts, Hoa Kỳ |
|||
Hình 11. Ví dụ về lớp phủ phân bố kích thước của ty thể có hai nồng độ khác nhau.
Tế bào động vật có vú và côn trùng
| Kích thước lỗ lọc (s) | Chất điện phân | Ghi chú chuẩn bị | Pha loãng |
| Multisizer sử dụng 70 µm
Z Series sử dụng 50 µm |
Isoton II
Môi trường nuôi cấy tế bào Đệm pha loãng nuôi cấy tế bào |
Sử dụng dung dịch điện phân đại diện cho môi trường nuôi cấy tế bào đang nghiên cứu hoặc lưu trữ. Điều này sẽ ngăn ngừa tình trạng tế bào bị sưng hoặc co lại ngoài ý muốn.
Sử dụng Nguyên lý Coulter được triển khai trong Bộ đếm Coulter, tác động của các chất tan ngoại bào có thể được nghiên cứu bằng cách thay đổi thành phần của chất lỏng huyền phù và phân tích dữ liệu thu thập được trên nhiều thành phần. Phương pháp này có thể được sử dụng để theo dõi những thay đổi kết quả về thể tích tế bào theo thời gian. |
Pha loãng thích hợp để đạt được nồng độ mẫu từ 5 – 10% trong bình đo |
Hình 12. Ví dụ về dòng tế bào côn trùng U937
Hình 13. Ví dụ về dòng tế bào CHO. Lưu ý thể tích tế bào tương tự như dòng U937 được hiển thị ở trên, nhưng có sự khác biệt rõ ràng về mặt định nghĩa.
Tế bào nấm men
| Kích thước lỗ lọc (s) | Chất điện phân | Ghi chú chuẩn bị | Pha loãng |
| Multisizer 30 hoặc 20 µm | Isoton II | Lọc chất điện phân qua màng lọc 0,22 µm. | Pha loãng thích hợp để đạt được nồng độ mẫu từ 5 – 10% trong bình đo |
Hình 14. Ví dụ về sự phân bố của Candida theo thể tích tế bào.
Hình 15. Ví dụ về phân bố kích thước của Candida theo đường kính tế bào
Tế bào nhân thực
| Kích thước lỗ lọc (s) | Chất điện phân | Ghi chú chuẩn bị | Pha loãng |
| Multisizer 70 µm
Z Series 70 µm |
Isoton II
Sea Water |
Không cần chuẩn bị đặc biệt | Pha loãng thích hợp để đạt được nồng độ mẫu từ 5 – 10% trong bình đo. |
Hình 16. Hai phân nhóm tế bào trong quá trình nuôi cấy đồng thời tảo xanh.
Xác minh cá tam bội hoặc lưỡng bội
Thể tích tế bào hồng cầu trung bình, thể tích nhân, phép đo tuyến tính và hàm lượng DNA của cá tam bội lớn hơn từ 1,2 đến 1,8 lần so với phép đo của cá lưỡng bội với ít sự chồng chéo giữa các phép đo. Đo thể tích nhân trung bình bằng bộ đếm Coulter cung cấp phương pháp phân biệt cá lưỡng bội với cá tam bội nhanh chóng và chính xác.
| Kích thước lỗ lọc (s) | Chất điện phân | Ghi chú chuẩn bị | Pha loãng |
| Multisizer 50 µm | Isoton II | Không cần chuẩn bị đặc biệt | Pha loãng thích hợp để đạt được nồng độ mẫu từ 5 – 10% trong bình đo. |
Hình 17. Hai phân nhóm tế bào trong quá trình nuôi cấy đồng thời tảo xanh.
Tế bào mô tim cardiosphere người và lợn
| Kích thước lỗ lọc (s) | Chất điện phân | Ghi chú chuẩn bị | Pha loãng |
| Multisizer 560 µm | Isoton II | Các mẫu được đo trong bình đựng mẫu 400 mL có khuấy để giữ cho các tế bào lơ lửng | Pha loãng thích hợp để đạt được nồng độ mẫu từ 5 – 10% trong bình đo. |
Hình 18. Ví dụ về sự khác biệt về quần thể tế bào trong tim cầu của người so với tim cầu của lợn. Lưu ý các đỉnh tổng hợp lớn giữa 200 và 300 µm.
Để đảm bảo các phép đo chính xác và tỉ mỉ, có một số biện pháp thực hành tốt nhất cần tuân theo. Trong phần này, Beckman Coulter mô tả các lĩnh vực chính cần cân nhắc khi lập kế hoạch cho các thí nghiệm của sử dụng
Đảm bảo độ chính xác của phép đo
Sử dụng lỗ lọc có kích thước phù hợp
Việc lựa chọn kích thước lỗ lọc phù hợp nhất phụ thuộc vào các tế bào được đo. Nếu mẫu bao gồm các tế bào chủ yếu trong phạm vi kích thước đường kính 40:1, thì có thể lựa chọn lỗ lọc phù hợp nhất. Ví dụ, lỗ lọc 100 µm trên Multisizer 4e có thể đo các tế bào có đường kính từ khoảng 2 đến 80 µm; khẩu độ 140 µm có thể đo các tế bào có đường kính từ khoảng 2,8 đến 112 µm.
Nếu quần thể tế bào không đồng nhất và do đó bao phủ phạm vi rộng hơn so với khả năng đo lường của một khẩu độ duy nhất, thì nên sử dụng hai hoặc nhiều lỗ lọc với kết quả thử nghiệm chồng chéo để cung cấp phân tích phân bố kích thước tế bào hoàn chỉnh.
Một yếu tố cần cân nhắc khi sử dụng các lỗ nhỏ hơn là chúng dễ bị tắc nghẽn hơn do các mảnh vụn trong huyền phù mẫu hoặc sự kết tụ của chính mẫu. Với bộ đếm COULTER, lỗ lọc được theo dõi để bất kỳ sự tắc nghẽn nào đối với lỗ đều dễ dàng nhận thấy. Các tắc nghẽn thường dễ dàng được thông qua bằng cách tạo áp suất ngược tức thời vào lỗ lọc hoặc bằng cách sử dụng cọ mềm. Trong trường hợp các công cụ trên không loại bỏ được tắc nghẽn, ống lỗ lọc có thể được tháo ra khỏi hệ thống và thông qua cách ngâm trong axit hoặc áp dụng áp suất ngược lớn hơn. Khi sử dụng các lỗ lọc, phải đặc biệt cẩn thận với dòng điện cao vì nó có thể làm hỏng lỗ lọc
Sử dụng chất điện giải thích hợp
Có một số cân nhắc khi lựa chọn chất điện phân mà các hạt sẽ được treo lơ lửng. Dung dịch phải tương thích về mặt hóa học với vật liệu mẫu và phải cho phép phân tán mẫu thích hợp. Thường xuyên xử lý bằng chất hoạt động bề mặt và sóng âm có thể là cần thiết. Dung dịch cũng phải về cơ bản không có các hạt trong phạm vi các hạt cần đo. Dung dịch điện phân thường được lọc bằng bộ lọc màng 0,22 hoặc 0,45 μm.
Về mặt điện, dung dịch phải có đặc tính tương tự như natri clorua 0,2-20% w/v trong nước. Điện trở trong lỗ lọc đo được trong dung dịch phải nằm trong khoảng từ 1 đến 100 kΩ, lý tưởng nhất là khoảng 5-40 kΩ. Vì Nguyên lý Coulter ban đầu được sử dụng để đếm tế bào máu, nên chất điện phân thường được sử dụng nhất là dung dịch muối sinh lý (0,9 g NaCl / 100 ml H2O). Dung dịch pha loãng Isoton II là dung dịch muối sinh lý đệm phosphat đã lọc, tương thích với tế bào máu người và được khuyến nghị sử dụng để huyền phù hầu hết các tế bào sinh học và nhiều mẫu công nghiệp.
Như đã đề cập trước đó, Nguyên lý Coulter có thể được sử dụng để đếm và xác định kích thước của bất kỳ tế bào hoặc hạt nào có thể lơ lửng trong một dung dịch điện giải. Để lơ lửng một số hạt lớn, có thể cần phải thêm một chất tạo đặc như glycerol hoặc sucrose để tăng độ nhớt của dung dịch. Chất tạo đặc cũng giúp giảm tiếng ồn do dòng chảy hỗn loạn của dung dịch điện giải có độ nhớt thấp tạo ra khi chúng đi qua các lỗ lọc có đường kính lớn (≥ 560 µm). Ngay cả khi khuấy tối đa và với các chất tạo đặc, các hạt lớn có thể không giữ được trạng thái lơ lửng đồng nhất đủ để cho phép một mẫu đại diện được đếm với kết quả có thể tái lập. Chính vì vấn đề lơ lửng của hạt mà các bình có đáy tròn gần như đã thay thế hoàn toàn các bình có đáy phẳng như là dụng cụ phổ biến khi áp dụng Nguyên lý Coulter. Một bình có đáy tròn cho phép phân tán đồng nhất hơn các hạt trong toàn bộ dung dịch, dẫn đến các phép đo nhất quán hơn.
Đối với các lỗ lọc, cần phải lọc trước nước khử ion và/hoặc Isoton II được sử dụng để nạp, xả hoặc vệ sinh hệ thống và các phụ kiện. Lọc Isoton II hoặc dung dịch pha loãng bằng bộ lọc 0,2 μm tương thích. Bộ lọc 0,1 μm cũng có thể được sử dụng nối tiếp với bộ lọc 0,2 μm để lọc bổ sung. Liên hệ với nhà cung cấp bộ lọc để xác định các thành phần lọc phù hợp cho ứng dụng
Hiệu chỉnh khẩu độ
Bộ đếm COULTER cung cấp hai phép đo cơ bản, số lượng tế bào và thể tích tế bào. Số lượng tế bào không cần hiệu chuẩn. Nguyên lý này tạo ra số lượng tế bào có thể được coi là chính xác, tùy thuộc vào hiệu chỉnh trùng hợp ngẫu nhiên. Tuy nhiên, phản ứng về kích thước tế bào phải được hiệu chuẩn.
Hiệu chuẩn được thực hiện bằng cách sử dụng các vật liệu chuẩn, chẳng hạn như mẫu cao su polyme. Các tiêu chuẩn hiệu chuẩn có thể truy xuất nguồn gốc NIST có thể được lấy từ Beckman Coulter Inc.. Đây là các mẫu cao su có phạm vi kích thước hẹp có kích thước đã được đo chính xác bằng một phương pháp khác và chúng được chuẩn hóa theo giá trị chế độ. Vật liệu được đo và chế độ phân phối kích thước được tạo ra có liên quan đến giá trị đã phân tích của cao su đó.
Sử dụng nồng độ mẫu thích hợp
Để đạt được độ chính xác đo lường tối đa, có hai yếu tố có khả năng cạnh tranh cần phải được xem xét. Thứ nhất, tổng số hạt được đếm phải đủ cao và thứ hai, nồng độ hạt phải sao cho không vượt quá giới hạn trùng hợp ngẫu nhiên. Trùng hợp ngẫu nhiên xảy ra khi nhiều hơn một hạt hoặc tế bào di chuyển qua vùng cảm biến cùng một lúc. Nói cách khác, tồn tại các điều kiện đếm lý tưởng với khối lượng đo lớn có nồng độ hạt thấp. Nhìn chung, các điều kiện này không có trong mẫu không pha loãng. Tuy nhiên, điều quan trọng là bất kỳ máy đếm/phân loại hạt nào cũng phải đo một số lượng lớn hạt để đạt được độ tin cậy thống kê lớn nhất trong kết quả. Khi không thể tích lũy một số lượng lớn số đếm, tức là dưới 100 tế bào, nên chạy phân tích ba lần và sử dụng giá trị trung bình thu được từ ba lần chạy.
Phần kết luận
Cho dù tế bào là vi khuẩn, tế bào động vật hay sinh vật phù du thì rõ ràng Nguyên lý Coulter là một trong những kỹ thuật phổ biến và dễ thích nghi nhất để nghiên cứu kích thước tế bào hoặc chỉ đơn giản là đếm tế bào. Đây là một công nghệ ổn định và đã được chứng minh kể từ khi được phát triển vào cuối những năm 1940.
By: Matthew Rhyner Ph.D., Giovanni Prestigiacomo, Kapil Kumar Ph.D., and Lena Lee
Nguồn:
Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các thiết bị định cỡ và đếm tế bào từ hãng Beckman Coulter.
EN