Trong kính hiển vi huỳnh quang ở cấp độ nghiên cứu hiện đại được trang bị hệ thống chiếu sáng và thấu kính ngưng tụ được hiệu chỉnh tốt, độ rọi (mức độ chiếu sáng) của trường nhìn trong các điều kiện nghiêm ngặt của chiếu sáng Köhler bị chi phối bởi một số yếu tố. Bao gồm độ sáng nội tại của nguồn sáng, tiêu cự của thấu kính thu, khẩu độ số tụ quang, kích thước màng chắn sáng và độ truyền qua tổng thể của hệ thống chiếu sáng. Trong chiếu sáng Köhler, ánh sáng phát ra từ mỗi điểm của nguồn phải chiếu sáng đồng đều màng chắn để tạo ra trường nhìn đồng nhất tương tự. Kích thước của khẩu độ trường chỉ ảnh hưởng đến đường kính của trường được chiếu sáng chứ không ảnh hưởng đến độ sáng của nó.
Hiệu suất tổng thể của các nguồn chiếu sáng khác nhau có sẵn cho kính hiển vi huỳnh quang phụ thuộc vào đặc tính phát xạ và hình dạng của nguồn, cũng như tiêu cự, độ phóng đại và khẩu độ số của hệ thống thấu kính thu. Ngược lại, những điều này lại bị ảnh hưởng bởi hình dạng và vị trí của thấu kính và gương trong hệ thống. Khi đánh giá mức độ phù hợp của một nguồn sáng cụ thể, các thông số quan trọng là cấu trúc (sự phân bố không gian của ánh sáng, hình dạng nguồn, sự kết hợp và căn chỉnh), sự phân bố bước sóng, độ ổn định không gian và thời gian, độ sáng và những thông số khác nhau này có thể ảnh hưởng đến mức độ nào. được kiểm soát. Cuộc thảo luận sau đây đề cập đến độ sáng, độ ổn định, sự kết hợp, phân bố bước sóng.
Độ sáng
Độ sáng hoặc độ rực rỡ của nguồn chiếu sáng được thiết kế để sử dụng trong kính hiển vi huỳnh quang là một trong những đặc điểm quan trọng nhất cần được xem xét do thực tế là cường độ của ảnh tỷ lệ nghịch với bình phương độ phóng đại theo phương trình:
Đèn hồ quang (chủ yếu là thủy ngân, xenon và halogen kim loại trong kính hiển vi huỳnh quang) thường có độ sáng cao hơn nhiều bậc so với đèn dây tóc vonfram-halogen có công suất tương đương, chủ yếu là do kích thước hồ quang nhỏ so với dây tóc đèn sợi đốt. Mặc dù trước đây đã có rất nhiều nỗ lực sử dụng điốt phát sáng làm nguồn sáng cho kính hiển vi nhưng nhìn chung chúng đều không thực hiện thành công do công suất bức xạ thấp của các thiết bị đời đầu. Các thiết kế được cấp bằng sáng chế trước đây để chiếu sáng kính hiển vi sử dụng số lượng lớn đèn LED được nhóm lại để tạo ra kiểu chiếu sáng đồng nhất. Cách tiếp cận này tạo ra thông lượng bức xạ cao hơn nhưng không giải quyết được vấn đề bức xạ thấp do nguồn phân tán lớn như vậy. Hiện nay, các điốt phát sáng mới đủ sáng để hoạt động riêng lẻ như một nguồn ánh sáng đơn sắc hiệu quả trong huỳnh quang hoặc ánh sáng đa sắc trong kính hiển vi trường nhìn rộng. Mặc dù bức xạ quang phổ của chúng vẫn thấp hơn so với các đỉnh quang phổ phát ra từ đèn hồ quang thủy ngân HBO 100 watt, nhưng nó đang tiến gần đến mức của đèn xenon XBO 75 watt trong quang phổ khả kiến. Khi sự phát triển của đèn LED được thúc đẩy bởi số lượng ứng dụng công nghiệp và thương mại ngày càng lớn, độ sáng của từng đơn vị diode chắc chắn sẽ tăng đáng kể trong vài năm tới. Lựa chọn bước sóng cũng nên mở rộng. Ngược lại, nhiều nguồn laser công suất cao dành cho kính hiển vi đồng tiêu đã có khả năng tạo ra năng lượng bức xạ mạnh hơn nhiều so với đèn hồ quang, đèn sợi đốt hoặc đèn LED.
Một ví dụ điển hình cho thấy tầm quan trọng của kích thước nguồn chiếu sáng so sánh các ống huỳnh quang 40 watt tương đối lớn thường được sử dụng để chiếu sáng trong phòng với đèn hồ quang thủy ngân HBO hồ quang ngắn 50 watt được sử dụng trong kính hiển vi huỳnh quang. Đèn huỳnh quang tạo ra hồ quang thủy ngân có độ khuếch tán cao, có chức năng kích thích lớp phủ bột phốt pho vô cơ lắng đọng trên thành trong của ống để tạo ra ánh sáng. Tuy nhiên, trong trường hợp của ống huỳnh quang, các photon phát ra từ bề mặt chứa nhiều phốt pho lớn có kích thước xấp xỉ 100 decimet vuông, trong khi mặt cắt ngang qua phần sáng nhất của đèn hồ quang thủy ngân có diện tích nhỏ hơn khoảng một triệu lần. Như sẽ được mô tả dưới đây, cơ chế khả thi duy nhất để tạo ra ánh sáng cực mạnh cần thiết để quan sát và chụp ảnh mẫu vật trong kính hiển vi là bắt đầu với một nguồn sáng rất tập trung. Do đó, phần ánh sáng do đèn hồ quang thủy ngân HBO tạo ra và được truyền thành công qua dãy quang học của kính hiển vi đến một khu vực xác định của mẫu vật (ví dụ: 100 micromet vuông) lớn hơn khoảng một triệu lần so với mức có thể đạt được khi sử dụng phốt pho. bề mặt của ống đèn huỳnh quang chiếu sáng trong nhà 40 watt.
Một trong những định luật cơ bản về quang học trong kính hiển vi huỳnh quang xác định phần ánh sáng thoát ra có thể tập trung vào hình ảnh của nguồn. Khái niệm này được minh họa trong Hình 3 cho một hệ thống chiếu sáng đơn giản chứa một nguồn sáng (H1), thấu kính quang học (L1) và hình ảnh được khử phóng đại của nguồn (H2) để thể hiện mối quan hệ giữa độ phóng đại và khẩu độ số. Khi hệ thống quang học (L1) tạo ra hình ảnh được khử phóng đại thì góc hội tụ (A2) lớn hơn góc phân kỳ (A1) thoát ra khỏi nguồn và được hệ thống quang học chấp nhận. Vì việc giảm diện tích do khử phóng đại được bù chính xác bằng việc tăng khẩu độ số nên hình ảnh không bao giờ có thể sáng hơn nguồn. Sóng ánh sáng phát ra từ nguồn không chạm vào hệ quang học sẽ không hội tụ vào ảnh ở mặt phẳng H2 . Mặc dù một phần ánh sáng bị mất này có thể được lấy lại bằng cách đặt một gương phản xạ hình cầu có tiêu điểm tập trung vào nguồn, nhưng vẫn sẽ có những giới hạn về độ sáng của H2 (lưu ý rằng về mặt vật lý không thể thu thập mọi photon phát ra từ nguồn ).
Mức độ sáng của nguồn chiếu sáng cần thiết để đáp ứng các yêu cầu khác nhau trong kính hiển vi huỳnh quang phụ thuộc nhiều vào kỹ thuật tương phản được sử dụng. Các phương pháp hình ảnh được áp dụng rộng rãi nhất là trường sáng, độ tương phản pha, độ tương phản giao thoa vi sai, ánh sáng phân cực và huỳnh quang. Ở mức cực đại, sự chiếu sáng huỳnh quang đòi hỏi ánh sáng gấp khoảng một triệu lần so với trường sáng. Hơn nữa, nhu cầu về lượng ánh sáng cũng phụ thuộc vào thời gian có sẵn để tích lũy hình ảnh (đối với mẫu cố định lớn hơn nhiều so với đối với tế bào sống), độ tương phản của hình ảnh và độ chính xác mà người điều tra phải có thể đo được độ tương phản. Ví dụ, khoảng 5 watt công suất quang được phát ra từ đèn halogen 100 watt dùng cho kính hiển vi ánh sáng truyền qua (trường sáng). Dây tóc của nguồn sáng này có kích thước khoảng 4,2 x 2,3 mm, có tiết diện khoảng 10 mm vuông. Thấu kính hình cầu trong kính hiển vi thông thường có khẩu độ số khoảng 0,7 (một nửa góc 45 độ) hoặc khoảng 15 phần trăm của góc đặc đầy đủ. Tuy nhiên, bằng cách sử dụng gương phản chiếu hình cầu trong đèn, giá trị này có thể tăng lên gấp đôi. Do những hạn chế về quang học được mô tả ở trên, ngay cả một hệ thống quang học hoàn hảo cũng chỉ có thể truyền một phần nghìn ánh sáng để chiếu sáng vùng 100 micromet vuông của mẫu vật. Điều này xảy ra bởi vì ngay cả những hệ thống quang học hiệu quả nhất (những hệ thống hoạt động ở độ phóng đại 1:1) cũng chỉ có thể sử dụng hiệu quả ánh sáng phát ra từ cùng một diện tích có kích thước (100 micromet vuông) của dây tóc. Như vậy, năng lượng ánh sáng có sẵn để chiếu sáng trường của vật kính có độ phóng đại cao nhỏ hơn 1,5 miliwatt (5 watt x 0,3 steradian x 0,001 phần trăm diện tích dây tóc hoạt động). Tình trạng tương tự cũng xảy ra với các nguồn sáng khác, bao gồm đèn LED, laser và đèn phóng điện hồ quang.
Dây tóc của đèn vonfram-halogen thường có hình dạng giống như đĩa hoặc dải phẳng, rộng để phù hợp với khẩu độ đầu vào của hệ thống quang học thu thập ánh sáng. Đèn hồ quang thường tạo ra ánh sáng dưới dạng phóng điện plasma tập trung gần đầu điện cực nhọn (thường là cực âm). Hai điện cực trong đèn hồ quang xenon có hình dạng khác nhau, trong đó cực dương có đường kính lớn hơn nhiều và phẳng hơn ở đầu. Kết quả là, ánh sáng phát ra sẽ có cường độ lớn nhất ở nơi các dòng từ thông tập trung nhiều nhất ở gần điểm cực âm, nhưng khi điện cực này ăn mòn theo thời gian thì trường từ thông giảm đi và quả cầu plasma ngày càng lớn hơn và ít cường độ hơn. Đèn vonfram và đèn hồ quang có hình dạng tương tự nhau nhưng có kích thước khác nhau. Phần sáng nhất của hồ quang trong đèn HBO thủy ngân thông thường có tiết diện khoảng 0,3 x 0,4 mm, trong khi dây tóc vonfram của đèn 100 watt có kích thước khoảng 4 x 2 mm, như đã thảo luận ở trên. Cả hai kích thước nguồn đều do nhà sản xuất đặt ra và không có tùy chọn khả thi nào để thay đổi chúng. Tương tự như vậy, nguồn LED điển hình bao gồm một tinh thể bán dẫn (thường được gọi làdie ) có kích thước từ khoảng 0,3 đến 2 mm vuông, tương tự như kích thước của đèn hồ quang và dây tóc vonfram-halogen. Một trong những ưu điểm của việc sử dụng đèn LED là khả năng kết hợp nhiều khuôn thành các hình dạng phù hợp lý tưởng để phù hợp với hình dạng của hệ thống quang học.
Bảng 1: Năng lượng bức xạ của nguồn chiếu sáng trong kính hiển vi huỳnh quang
| Đèn | Thông lượng bức xạ (milliwatts) | Quang thông (lumen) | Bức xạ quang phổ (mW/m²/nm) | Kích thước nguồn (H x W, mm) |
| Vonfram-Halogen (100 W) | 4000 | 2800 | <1 (350-700 NM) | 4,2 x 2,3 |
| Thủy ngân HBO (100 W) | 3200 | 2200 | 30 (350-700nm) | 0,25 x 0,25 |
| Xenon XBO (75 W) | 1460 | 1000 | 7 (350-700nm) | 0,25 x 0,50 |
| Halogen kim loại | 3800 | 2600 | 55 (350-700nm) | 1,0 x 0,3 |
| LED (Xanh lục, 520nm) | 10 | 15,9 | 4,5 | 0,25 x 0,25 |
Trình bày trong Bảng 1 là sự so sánh các tính chất quang học và vật lý của các nguồn chiếu sáng phổ biến cho kính hiển vi quang học. Đèn HBO 100 watt thủy ngân có độ sáng cao nhất (và độ chói trung bình) so với đèn ở bất kỳ mức năng lượng nào thường được sử dụng trong kính hiển vi, chủ yếu là do kích thước nguồn rất nhỏ của nó. Đối với người sử dụng kính hiển vi, hàm lượng quang phổ của nguồn sáng phát ra (được gọi trong Bảng 1 là bức xạ quang phổ), là yếu tố rất quan trọng cần cân nhắc khi so sánh các nguồn sáng khác nhau. Thông lượng bức xạ xác định tích phân của ánh sáng phát ra ở tất cả các bước sóng và không cung cấp thông tin về sự phân bố quang phổ của nó (trong thực tế, số lượng và cường độ của các bước sóng khác nhau thực sự được phát ra). Điều này đặc biệt rõ ràng khi các đơn vị trắc quang, chẳng hạn như độ chói trung bình, được sử dụng để so sánh các nguồn khác nhau. Bởi vì các đơn vị trắc quang được tính theo độ nhạy quang phổ giới hạn của mắt người, nên đầu ra ở tia cực tím và hồng ngoại có hệ số trọng số rất nhỏ so với ánh sáng xanh lục (ở giữa đường cong phản ứng của mắt người). Việc so sánh giữa quang thông hoặc quang thông của nguồn sáng đa sắc và đơn sắc (chẳng hạn như laser và đèn LED) sẽ không có ý nghĩa nếu chỉ sử dụng một phần quang phổ giới hạn của đầu ra từ nguồn đa sắc.
Quang phổ đầu ra của đèn vonfram-halogen phụ thuộc vào điện áp đặt vào đèn bằng cách thay đổi chiết áp trên nguồn điện. Ở điện áp cao hơn, quang thông tăng theo nhiệt độ màu, do đó làm tăng độ sáng của bước sóng trong vùng quang phổ khả kiến. Chỉ 47% lượng bức xạ phát ra từ đèn HBO 100 thủy ngân nằm trong khoảng bước sóng từ 320 đến 700 nanomet. Hơn nữa, hầu hết năng lượng đó tập trung ở các vạch quang phổ nổi bật ở 365 nanomet (i line; 10,7 phần trăm), 436 nanomet (g line; 12,6%), 546 nanomet ( e line; 7,1%) và 579 nanomet (7,9%). Công suất có thể sử dụng được từ đèn xenon XBO 75, mặc dù tương đối đồng nhất trong phạm vi từ 320 đến 700 nanomet, nhưng chỉ chiếm khoảng 25% tổng số, với phần lớn năng lượng rơi vào các bước sóng ít hữu ích hơn trong vùng phổ hồng ngoại (khoảng 70% của đầu ra ở bước sóng dài hơn 700 nanomet).
Sự ổn định
Các nguồn chiếu sáng dựa trên sự phóng điện plasma (đèn hồ quang), đèn sợi đốt (đèn halogen-vonfram) hoặc phát xạ kích thích trong môi trường khí (laser khí) cần một khoảng thời gian đáng kể sau khi đánh lửa để đạt được trạng thái cân bằng nhiệt, một yếu tố có thể ảnh hưởng đến thời gian, không gian, và độ ổn định quang phổ. Tất cả các loại đèn tạo ra mức nhiệt đáng kể, bao gồm cả điốt phát sáng, cũng thể hiện sự phụ thuộc của công suất phát thải vào nhiệt độ nguồn. Trong nhiều trường hợp, cần có khoảng thời gian lên tới một giờ cho đến khi nguồn chiếu sáng đủ ổn định để có thể thực hiện các phép đo có thể lặp lại hoặc ghi lại các chuỗi video tua nhanh thời gian mà không có sự thay đổi cường độ đáng kể theo thời gian. Khi đã đạt đến nhiệt độ hoạt động thích hợp, đèn halogen-vonfram là nguồn sáng thông thường ổn định nhất trong khoảng thời gian vài mili giây do quán tính nhiệt cao của dây tóc vonfram. Các nguồn diode phát sáng có khả năng phản ứng cực nhanh (trong vòng vài micro giây), nhưng các phiên bản có công suất cao nhất cũng có thể tạo ra một lượng nhiệt đáng kể trong quá trình khởi động và do tốc độ cao nên bị ảnh hưởng bởi sự mất ổn định tần số cao trong nguồn điện. Nhìn chung, đèn phóng điện hồ quang là nguồn chiếu sáng không ổn định nhất hiện nay được sử dụng trong kính hiển vi huỳnh quang. Bên cạnh thực tế là hồ quang có mức độ phóng điện nhấp nháy, hỗn loạn đáng kể và lượng ánh sáng phát ra cũng có thể bị ảnh hưởng bởi các trường điện từ xung quanh hoặc nguồn điện không ổn định. Các nguồn diode phát sáng có khả năng phản ứng cực nhanh (trong vòng vài micro giây), nhưng các phiên bản có công suất cao nhất cũng có thể tạo ra một lượng nhiệt đáng kể trong quá trình khởi động và do tốc độ cao nên bị ảnh hưởng bởi sự mất ổn định tần số cao. trong nguồn điện. Nhìn chung, đèn phóng điện hồ quang là nguồn chiếu sáng không ổn định nhất hiện nay được sử dụng trong kính hiển vi huỳnh quang. Bên cạnh thực tế là hồ quang có mức độ phóng điện nhấp nháy, hỗn loạn đáng kể và xấu đi theo thời gian, lượng ánh sáng phát ra cũng có thể bị ảnh hưởng bởi các trường điện từ xung quanh hoặc nguồn điện không ổn định.
Trong một số trường hợp, độ ổn định của nguồn sáng có thể được tăng lên bằng cách sử dụng tín hiệu từ cảm biến ánh sáng trong vòng phản hồi để điều khiển điện áp và/hoặc dòng điện đầu ra của nguồn điện. Một loạt các thiết bị có khả năng cải thiện độ ổn định của nguồn hồ quang và halogen từ 0,01 đến 0,4%. Tuy nhiên, những số liệu này biểu thị tổng lượng ánh sáng phát ra và các thiết bị điều khiển không thể ngăn hiện tượng nhấp nháy cục bộ ở bất kỳ vùng cụ thể nào của plasma có thể được chiếu vào một khu vực quan trọng, chẳng hạn như khu vực trung tâm của trường nhìn.
Để có độ ổn định lâu dài, nguồn sáng vonfram-halogen và điốt phát sáng thể hiện hiệu suất tốt nhất khi so sánh với đèn hồ quang và laser khí (mặc dù một số loại laser diode mới hơn ổn định hơn nhiều). Khi đèn vonfram-halogen đã đạt được nhiệt độ hoạt động và nếu đèn được điều khiển bằng nguồn điện ổn định thì nguồn này phù hợp để tiến hành các phép đo quang nhạy. Do đó, đèn vonfram-halogen 100 watt là một trong những nguồn sáng ưa thích để chụp ảnh các tế bào sống bằng cách sử dụng các kỹ thuật tăng cường độ tương phản ánh sáng truyền qua trong các thử nghiệm, từ chỉ chụp một vài khung hình cho đến những trường hợp cần hàng trăm hoặc thậm chí hàng nghìn hình ảnh liên tiếp. Bốn trong số các phương thức hình ảnh chính đã được sử dụng thành công với đèn vonfram-halogen để chụp ảnh tế bào sống là độ tương phản giao thoa vi sai (DIC), độ tương phản pha, ánh sáng phân cực và độ tương phản điều chế Hoffman. Đèn sợi đốt đặc biệt ổn định trong thời gian dài và chỉ chịu sự dao động đầu ra ở mức độ nhỏ (cả thời gian và không gian) trong điều kiện hoạt động bình thường. Nguồn cung cấp điện được điều chỉnh thường không cần thiết, ngoại trừ những phòng thí nghiệm có đường dây điện chịu sự dao động điện áp thường xuyên.
Nhìn chung, đèn hồ quang có độ ổn định kém hơn đáng kể so với đèn dây tóc vì plasma khí vốn không ổn định và có thể bị ảnh hưởng bởi cả từ trường và sự xói mòn của đầu điện cực. Bán kính cong lớn hơn xảy ra từ từ dẫn đến giảm dòng điện (và độ sáng) gần đầu cực âm và cũng làm tăng mức năng lượng cần thiết để duy trì hồ quang. Độ ổn định ngắn hạn bị ảnh hưởng bởi ba hiện tượng tái diễn của sự phóng điện hồ quang được tạo ra giữa các điện cực vonfram: (1) Sự trôi hồ quang xảy ra khi điểm gắn của hồ quang trên đầu cực âm hình nón đi qua điện cực theo hình tròn (xem Hình 4( a)), thường cần vài giây để hoàn thành toàn bộ vòng tròn. (2) Flare đề cập đến sự thay đổi nhất thời về độ sáng khi hồ quang di chuyển đến một khu vực mới trên cực âm với chất lượng phát xạ cao hơn điểm gắn trước đó (Hình 4(b)). (3) Dòng đối lưu trong khí xenon hoặc hơi thủy ngân phát sinh từ sự chênh lệch nhiệt độ giữa hồ quang và vỏ tạo ra sự rung hồ quang, biểu hiện bằng sự dịch chuyển nhanh sang một bên của cột hồ quang (Hình 4(c)). Cuối cùng, các điện cực bị hư hỏng đến mức đèn không còn cháy nữa. Đèn hồ quang cũng phải chịu các hiện tượng như dao động plasma và thoát nhiệt , tương ứng được biểu hiện dưới dạng dao động nhanh của mật độ electron khi dẫn plasma và làm nóng quá mức các điện cực.
Có một số cơ chế để tăng độ ổn định theo thời gian của đèn hồ quang. Ví dụ, cường độ của hồ quang xenon có thể được điều chỉnh sâu và nhanh chóng theo thời gian để giảm nhiệt độ hoạt động của điện cực, tương tự như tình huống với các bộ đèn nháy điện tử trong chụp ảnh thông thường. Ngoài ra, vị trí của hồ quang plasma có thể được ổn định bằng cách tạo ra một từ trường định kỳ gần hồ quang bằng nam châm vĩnh cửu quay hoặc thông qua việc đặt một dòng điện xoay chiều tần số cao, nhỏ trên mạch cấp nguồn chính (dòng điện một chiều; DC ) . . Đèn hồ quang halogen kim loại chứa các halogen dạng khí, chẳng hạn như iốt và brom, ngoài thủy ngân, và hoạt động thông qua một quá trình được gọi là chu trình tái tạo halogen, trong đó các halogen ngăn không cho vonfram bay hơi phát ra từ các điện cực lắng đọng trên thành bên trong của lớp vỏ thạch anh, do đó kéo dài đáng kể tuổi thọ hữu ích và độ ổn định của đèn. Những đèn này đang nhanh chóng trở thành một trong những nguồn chiếu sáng được ưa thích nhất trong kính hiển vi huỳnh quang.
Về độ ổn định bước sóng, hầu hết các nguồn sáng đều có thể được kiểm soát để cung cấp phạm vi phát xạ có thể tái tạo trong suốt tuổi thọ của chúng. Trong trường hợp đèn hồ quang phóng điện, áp suất khí ảnh hưởng đến thành phần của quang phổ. Khi áp suất tăng trong quá trình hoạt động, các vạch quang phổ mở rộng và tính liên tục tăng lên, nhưng bước sóng cực đại của các vạch nổi bật có xu hướng dịch chuyển ít hơn 5 nanomet. Quang phổ liên tục của đèn sợi đốt (vonfram-halogen) chỉ phụ thuộc vào nhiệt độ của dây tóc và tính chất của khí nạp trong vỏ. Ở dòng điện cố định, sự thay đổi nhiệt độ màu (phân bố bước sóng) chỉ có thể xảy ra nếu vonfram bay hơi ngưng tụ trên thành trong của vỏ thạch anh. Khi vận hành đèn LED, một sự thay đổi về dòng điện có thể tạo ra sự dịch chuyển của đỉnh phát xạ có độ lớn tương tự như độ lớn nhìn thấy ở các đường truyền của đèn hồ quang. Hiệu ứng này có thể xảy ra nếu khuôn LED không hoàn toàn đồng nhất và kích thước của sự dịch chuyển thường phụ thuộc vào loại và chất lượng của tinh thể bán dẫn được sử dụng để chế tạo thiết bị. Bởi vì sự thay đổi bước sóng thường nhỏ so với các bộ lọc thông dải được sử dụng trong kích thích huỳnh quang nên các dao động quang phổ thường có thể bị bỏ qua với đèn hồ quang. Đối với đèn LED, độ ổn định bước sóng có thể được đảm bảo bằng cách hiệu chỉnh đầu ra quang phổ bằng dòng điện hoạt động trước khi bắt đầu thí nghiệm. Bởi vì sự thay đổi bước sóng thường nhỏ so với các bộ lọc thông dải được sử dụng trong kích thích huỳnh quang nên các dao động quang phổ thường có thể bị bỏ qua với đèn hồ quang. Đối với đèn LED, độ ổn định bước sóng có thể được đảm bảo bằng cách hiệu chỉnh đầu ra quang phổ bằng dòng điện hoạt động trước khi bắt đầu thí nghiệm. Bởi vì sự thay đổi bước sóng thường nhỏ so với các bộ lọc thông dải được sử dụng trong kích thích huỳnh quang nên các dao động quang phổ thường có thể bị bỏ qua với đèn hồ quang. Đối với đèn LED, độ ổn định bước sóng có thể được đảm bảo bằng cách hiệu chỉnh đầu ra quang phổ bằng dòng điện hoạt động trước khi bắt đầu thí nghiệm.
Nguồn điện được sử dụng để kiểm soát đầu ra của nguồn chiếu sáng có thể có tác động nghiêm trọng đến độ ổn định. Đèn vonfram-halogen được điều khiển bằng nguồn điện một chiều ổn định, chuyển đổi dòng điện thành điện áp có thể điều chỉnh trong khoảng từ 2 đến 12 volt. Thay đổi điện áp đầu ra bằng chiết áp sẽ kiểm soát nhiệt độ dây tóc và do đó, tính chất quang phổ và cường độ của đèn. Đèn hồ quang cũng được điều khiển bởi nguồn điện ổn định hiện tại. Trong một số trường hợp, dòng điện của đèn có thể giảm xuống 70% để giảm công suất quang và bảo toàn các điện cực, nhưng dưới mức này, quá trình phóng điện plasma trở nên không ổn định. Đèn hồ quang xenon có dây tóc đốt nóng quấn quanh bóng đèn giúp kiểm soát áp suất hơi khi kích hoạt, cho phép giảm dòng điện của đèn xuống khoảng 30 phần trăm mà không làm gián đoạn quá trình phóng điện. Cả đèn hồ quang và đèn sợi đốt đều không thể bật và tắt nhanh chóng. Để thay đổi bước sóng hoặc cường độ phát xạ một cách có kiểm soát, phải sử dụng cửa chớp cơ học và bánh xe lọc (chúng có thời gian chuyển đổi từ 10 đến 100 mili giây). Ngược lại, đèn LED có thể được bật hoặc tắt trong khoảng thời gian micro giây chỉ bằng nguồn điện.
Có lẽ một trong những khía cạnh ổn định quan trọng nhất của bất kỳ nguồn sáng nào được thiết kế cho kính hiển vi huỳnh quang là đối phó với nhiệt có khả năng gây hại bằng cách sử dụng một bộ tản nhiệt hiệu quả. Đèn sợi đốt và đèn hồ quang tạo ra một lượng nhiệt đáng kể do hiệu suất chuyển đổi quang học thấp (dao động từ 5 đến 10%). Giá đỡ và vỏ của những chiếc đèn này được chế tạo bằng vật liệu chịu được nhiệt độ cao và được thiết kế để tản nhiệt khoảng 100 watt. Kết quả là đèn hồ quang và đèn sợi đốt không thể được gắn bên trong kính hiển vi. Mặc dù các đèn LED hiện có có hiệu suất chuyển đổi tương tự nhưng sản lượng photon của chúng xuất hiện trên một dải phổ hẹp nên đèn LED hoạt động ở nhiệt độ thấp hơn nhiều. Do đó, đèn LED cần ít năng lượng điện hơn để tạo ra cùng một đầu ra quang học, và chúng có thể nhỏ gọn hơn và được liên kết trực tiếp với tản nhiệt kim loại được làm mát bằng quạt. Công nghệ này cho phép đèn LED, không giống như các nguồn khác, được gắn bên trong kính hiển vi và gần mẫu hơn (để tránh mất ánh sáng trong quá trình vận chuyển). Cần lưu ý rằng các nguồn dựa trên đèn LED vẫn cần một bộ tản nhiệt hiệu quả vì hoạt động ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ phòng sẽ làm giảm tuổi thọ của chúng và dẫn đến mất hiệu suất đầu ra quang học.
Đặc điểm bước sóng
Một trong những biến số quan trọng nhất cần xem xét khi lựa chọn nguồn chiếu sáng cho kính hiển vi là sự phân bố quang phổ hoặc cấu hình bước sóng do nguồn phát ra. Mặc dù nguồn sáng sợi đốt và một số đèn hồ quang tạo ra ánh sáng trắng thể hiện độ sáng khá đồng đều trên vùng bước sóng khả kiến, điều này không đúng với đèn LED, laser và một số đèn hồ quang (thủy ngân và halogen kim loại). Trong lịch sử, chất huỳnh quang đã được lựa chọn để sử dụng trong kính hiển vi huỳnh quang vì chúng đặc biệt bị kích thích bởi các vạch cường độ cao do đèn hồ quang thủy ngân tạo ra. Chiến lược này không chỉ giúp tăng độ sáng mà còn tận dụng băng thông hẹp trong thiết kế gương lưỡng sắc hiệu quả và bộ lọc giao thoa màng mỏng. Ngoài ra, vật kính kính hiển vi thường được thiết kế để tạo ra hiệu chỉnh màu sắc tối ưu ở các bước sóng này. Đèn xenon thiếu dấu hiệu quang phổ như đèn thủy ngân, tuy nhiên chúng có lẽ còn hữu ích hơn nữa vì phổ liên tục của chúng có thể được sử dụng một cách hiệu quả để kích thích đồng thời nhiều chất phát quang với hiệu suất gần như bằng nhau. Ngược lại, các vạch phát xạ laser và LED hiếm khi trùng với đầu ra của đèn hồ quang thủy ngân, vì vậy những nguồn sáng này đòi hỏi phải có sự đánh giá mới về chất huỳnh quang phù hợp và bộ lọc phù hợp.
Trong những ngày đầu của kính hiển vi, ngọn lửa của nến và mặt trời là một trong những nguồn chiếu sáng ưa thích của các nhà kính hiển vi đang phát triển. Cả hai nguồn đều là plasma nóng phát ra bức xạ black-BODY với việc bổ sung một số dòng nguyên tố. Mặt trời có mức độ sáng (bức xạ) rất cao và thể hiện quang phổ liên tục của bộ bức xạ black-BODY có nhiệt độ bề mặt 5800 K, cho phép dễ dàng lựa chọn các bước sóng cụ thể. Trên thực tế, một kính định nhật chạy bằng đồng hồ đã được một nhóm nghiên cứu áp dụng để theo dõi mặt trời làm nguồn sáng cho kính hiển vi, nhưng kĩ thuật này không thực tế ngoài việc chứng minh tính khả thi. Ngoài mặt trời, chỉ có synchrotron mới có thể cung cấp quang phổ sáng và liên tục như nhau.
Tương tự như mặt trời, đèn sợi đốt cũng tạo ra bức xạ black-BODY với sự phân bố quang phổ phụ thuộc vào nhiệt độ dây tóc. Ở điện áp hoạt động bình thường, dây tóc đèn vonfram-halogen phát ra ở nhiệt độ màu từ 3200 K đến 3400 K, tạo ra ánh sáng ít cường độ hơn và chuyển sang bước sóng dài hơn khi so sánh với ánh sáng mặt trời. Mặc dù có thể tăng các thành phần bước sóng xanh bằng cách tăng nhiệt độ dây tóc, nhưng hành động này làm tăng tốc độ thăng hoa của vonfram và gây bất lợi cho tuổi thọ của đèn. Hơi vonfram bay hơi ngưng tụ trên bề mặt bên trong của lớp vỏ thạch anh, nơi nó hấp thụ ánh sáng từ nguồn và làm nóng lớp vỏ. Cuối cùng, dây tóc trở nên quá mỏng để tồn tại. Khí halogen trong đèn vonfram-halogen làm gián đoạn quá trình làm đen bằng cách phản ứng đầu tiên với vonfram bay hơi để tạo thành các hợp chất khí vonfram-oxyhalua, sau đó phân hủy và lắng đọng lại vonfram khi chúng tác động lên dây tóc nóng. Chu kỳ này, được gọi là chu trình tái sinh halogen , cho phép dây tóc vonfram hoạt động ở nhiệt độ cao hơn với ít độ sẫm màu và thời gian trung bình dài hơn trước khi hỏng. Một mối nguy hiểm khác với đèn sợi đốt là nhiệt độ hoạt động cao hơn có thể làm biến dạng cấu trúc dây tóc, khiến nó dịch chuyển khỏi vị trí bình thường trong hệ thống quang học.
Cấu hình phổ phát xạ của nguồn hồ quang có thể được chia thành ba loại: phổ liên tục, phổ vạch và hỗn hợp các phổ vạch và phổ liên tục. Một nỗ lực đáng kể đã được thực hiện trong nhiều thập kỷ qua để tổng hợp các chất huỳnh quang mới có cực đại hấp thụ trùng với các vạch phổ thủy ngân nổi bật. Ví dụ: các đầu dò như rhodamine và các chất tổng hợp mới hơn như MitoTracker Red hấp thụ hiệu quả các vạch thủy ngân lần lượt là 546 và 579, trong khi loạt thuốc nhuộm Alexa Fluor đã được tinh chỉnh với cực đại tương ứng với hầu hết các đỉnh thủy ngân (Alexa Fluors 350, 405, 440, 546 và 568). Đèn halogen kim loại chứa các vạch quang phổ tương tự như đèn thủy ngân, nhưng cũng thể hiện cường độ ngoài đỉnh mạnh hơn khoảng 50%. Về vấn đề này, các chất huỳnh quang không bị kích thích mạnh bởi các đỉnh trong phổ phát xạ của đèn thủy ngân, chẳng hạn như Alexa Fluor 488 và fluorescein, sẽ tạo ra hình ảnh sáng hơn với các nguồn chiếu sáng halogen kim loại. Đèn xenon, mặc dù không sáng bằng, cung cấp mức độ kích thích gần như không đổi cho các chất huỳnh quang trên toàn bộ quang phổ khả kiến. Không giống như đèn thủy ngân và đèn halogen kim loại, đèn hồ quang xenon hoạt động ở áp suất thường vượt quá 40 atm, giúp mở rộng các vạch quang phổ. Hơn nữa, do cường độ liên tục của đèn xenon áp suất cao 75 watt sáng gần gấp đôi so với cường độ liên tục của đèn thủy ngân 100 watt, nên đèn xenon phù hợp hơn với các huỳnh quang hiệu suất thấp không có cấu hình hấp thụ trùng với bất kỳ vạch quang phổ thủy ngân.
Nói chung, nên sử dụng phạm vi bước sóng của nguồn chiếu sáng ít gây hại nhất cho mẫu vật để chụp ảnh tế bào sống. Các cuộc điều tra mở rộng cho biết rằng hầu hết các tế bào có ít khả năng chịu đựng tia cực tím và hồng ngoại, đồng thời ít nhạy cảm nhất với các bước sóng màu đỏ, tiếp theo là các tế bào ở vùng xanh lục và xanh lam. Vì vậy, thật hợp lý khi sử dụng ánh sáng từ vàng đến đỏ (550 đến 650 nanomet) để nghiên cứu tế bào sống bất cứ khi nào có thể mặc dù bước sóng dài hơn buộc phải thỏa hiệp về độ phân giải và một số camera CCD kém nhạy hơn ở vùng này. Vấn đề về độ phân giải ít quan trọng hơn khả năng tồn tại của tế bào và thường bị giới hạn ở mức độ lớn hơn bởi các chuyển động bên trong tế bào, sự chênh lệch nhiệt độ và sự không hoàn hảo trong hệ thống quang học và chiếu sáng.
Tính nhất quán
Một trong những thông số quan trọng của nguồn chiếu sáng là tính kết hợp của chúng, phần nào liên quan đến độ sáng do thực tế là các nguồn sáng cực sáng thường có độ kết hợp cao hơn. Trên thực tế, thuật ngữ độ sáng thực sự hữu ích hơn nhiều khi mô tả khả năng của một nguồn sáng tập trung một số lượng lớn photon vào một khu vực nhỏ, trong khi độ kết hợp là thước đo khả năng của các hàm sóng mô tả các photon này giao thoa với nhau. Các nguồn sáng tương đối không kết hợp sẽ hạn chế sự giao thoa của chúng với mặt phẳng tiêu cự của kính hiển vi trong khi các nguồn sáng có độ kết hợp cao tạo ra sự phản xạ từ hầu hết mọi hạt bụi và những lỗi trong hệ thống quang học. Nói chung, ánh sáng không phải laser được phân biệt với ánh sáng laser ở mức độ kết hợp thấp hơn nhiều. Ánh sáng không kết hợp, chẳng hạn như ánh sáng mặt trời từ bầu trời nhiều mây và ánh sáng kết hợp từ tia laser, đều là những cấu trúc lý thuyết hạn chế. Mặc dù việc sử dụng các giới hạn có điều kiện này giúp đơn giản hóa quá trình viết các phương trình mô tả quá trình hình thành hình ảnh trong kính hiển vi, nhưng không có sự kết hợp cực đoan nào thực sự có thể được nhận ra trong thực tế.
Theo nghĩa thực tế, ánh sáng được coi là không kết hợp khi không có hiệu ứng đốm và kết hợp khi chúng xuất hiện. Trên thực tế, hầu hết các nguồn sáng đều thể hiện cả sự kết hợp không gian liên quan đến kích thước góc của nguồn và sự kết hợp thời gian liên quan đến cấu hình bước sóng của nó. Mặc dù mặt trời được coi là một nguồn không nhất quán, nhưng ánh sáng mặt trời vẫn có đủ độ kết hợp để tạo ra các đốm cho hình ảnh được tạo ra trong kính hiển vi. Đèn dây tóc vonfram và đèn LED có độ kết hợp không gian tương đối thấp do kích thước bộ phát lớn. Ngược lại, đèn hồ quang có độ kết hợp cao hơn trừ khi sử dụng một diện tích lớn plasma làm nguồn. Đối với các ứng dụng kính hiển vi trường sáng và kính hiển vi phản xạ, thường mong muốn chiếu sáng có độ kết hợp thấp, trong khi ánh sáng có độ kết hợp cao hơn là cần thiết cho các chế độ hình ảnh pha và giao thoa. Quá trình phát quang bao gồm đủ số bước giữa kích thích và phát xạ nên sự kết hợp của ánh sáng chiếu vào thường không quan trọng và ánh sáng phát ra từ mẫu vật về cơ bản là không kết hợp.
Hiệu ứng đốm sẽ sáng nếu sự giao thoa ánh sáng từ bên trong tâm tán xạ xung quanh một điểm cụ thể có tính tăng cường với ánh sáng từ nền và tối nếu xảy ra giao thoa triệt tiêu. Kích thước biểu kiến của tâm tán xạ và kích thước của từng đốm riêng lẻ có liên quan đến giới hạn độ phân giải (hoặc khẩu độ số) của hệ quang học. Trong trường hợp chiếu sáng không kết hợp, sự chồng chéo giữa các mẫu đốm có bước sóng khác nhau sẽ bị loại bỏ một phần để tạo ra mẫu có độ tương phản thấp hơn. Vì đốm là kết quả của hiện tượng giao thoa nên bất kỳ chuyển động nào của hệ thống quang học hoặc mẫu vật sẽ dẫn đến sự thay đổi phức tạp của kiểu đốm theo thời gian.
Một trong những chức năng chính của hệ thống chiếu sáng Köhler là làm cho nguồn sáng đồng nhất ở các mặt phẳng hình ảnh và kiểm soát sự kết hợp của nó ở một mức độ hạn chế. Tuy nhiên, chỉ có một hệ thống hoàn toàn mạch lạc mới không làm xáo trộn ánh sáng ở mức độ đáng kể. Việc xáo trộn bổ sung thường là cần thiết để giảm tính đồng nhất về không gian, cũng như sự gắn kết về không gian và thời gian. Mặc dù hầu hết các bộ xáo trộn ánh sáng (chẳng hạn như bộ dẫn ánh sáng bằng sợi quang) đã được thiết kế để hoạt động với ánh sáng laser có độ kết hợp cao, nhưng các kỹ thuật tương tự cũng có thể được áp dụng để làm giảm sự kết hợp ánh sáng từ các nguồn khác.
Tính đồng nhất
Chiếu sáng Köhler là sơ đồ chiếu sáng quang học phổ biến nhất cho cả kính hiển vi ánh sáng truyền qua và phản xạ vì nó dùng để chiếu sáng đồng đều trường hình ảnh bằng cách sử dụng nguồn không gian phức tạp bằng cách chỉ tạo ảnh một phần của nguồn tại mặt phẳng tiêu điểm của tụ quang (hoặc mặt phẳng tiêu điểm phía sau vật kính chiếu sáng epi). Ánh sáng chiếu vào mẫu vật được phân bố đều, mặc dù ánh sáng này có thể không tới từ mọi góc có thể với cường độ như nhau. Khẩu độ trường (thực tế nằm trong mặt phẳng hình ảnh trung gian) được chụp ảnh trên mẫu vật để hạn chế vùng được chiếu sáng mà không ảnh hưởng đến góc của ánh sáng chiếu sáng. Trong trường hợp nguồn không đồng nhất cao, có thể thêm bộ khuếch tán vào hệ thống quang học để cải thiện hơn nữa tính đồng nhất ở mặt phẳng tiêu cự. Hệ thống chiếu sáng Köhler không phải là hệ thống hiệu quả nhất vì nó không tận dụng được toàn bộ bề mặt của nguồn hoặc phân bố góc đầy đủ của ánh sáng phát ra.
Do thực tế là sự chiếu sáng Köhler không bao gồm toàn bộ bề mặt của nguồn hoặc sự phân bố góc đầy đủ của ánh sáng phát ra, nên cấu hình chiếu sáng kính hiển vi này tương đối kém hiệu quả đối với photon. Ngoài ra, do thấu kính tụ quang phải có khẩu độ số phù hợp với khẩu độ của vật kính nên nó phải được lấy nét chính xác nếu màng ngăn trường vẫn được lấy nét chính xác trên mặt phẳng mẫu vật. Trên nhiều kính hiển vi thẳng đứng, tụ quang và bệ di chuyển như một đơn vị sao cho sự dịch chuyển của bệ dọc theo trục quang của kính hiển vi (trên thực tế là lên hoặc xuống) cũng di chuyển tụ quang khỏi vị trí thẳng hàng quan trọng cần thiết cho chiếu sáng Köhler. Ngoài ra, vì các phiến kính hiển vi và các phiến kính thường có độ dày khác nhau lên tới hàng chục micromet, nên
Khi kiểm tra tính đồng nhất của sự phân bố nguồn sáng trong kính hiển vi, cần lưu ý rằng sự chiếu sáng Köhler chứa đựng những giả định không được chứng minh trong thực tế. Điều cần cân nhắc chính chưa được thực hiện đó là nguồn là phẳng và do đó, ánh sáng mới có thể tập trung hoàn hảo vào các mặt phẳng khác theo sơ đồ vết tia thường được sử dụng để giải thích sự chiếu sáng Köhler. Trên thực tế, cả đèn hồ quang và nhiều nguồn sáng sợi đốt đều có kích thước gần giống hình cầu. Kết quả là, ngay cả khi hệ thống quang học tập trung chính xác ánh sáng từ mặt phẳng trung tâm của quả cầu chiếu sáng vào mặt phẳng tiêu cự phía sau của tụ quang (hoặc vật kính) của kính hiển vi, một số lượng đáng kể các photon phát ra từ các mặt phẳng bị loại bỏ khỏi mặt phẳng trung tâm của hình cầu (ở phía trước hoặc phía sau mặt phẳng này) sẽ không tập trung hoàn hảo ở mặt phẳng tụ điện hoặc bất kỳ mặt phẳng liên hợp nào khác trong sơ đồ cho vấn đề đó (xem Hình 8). Hậu quả nghiêm trọng nhất của sai sót này trong quá trình chiếu sáng Köhler là một số cấp độ cấu trúc vẫn hiện diện trên mặt phẳng mẫu vật.
Vị trí chiến lược của các thành phần quang học cũng là yếu tố then chốt trong việc tạo ra tính đồng nhất của nguồn chiếu sáng. Các hệ thống thấu kính thu điển hình có khẩu độ số lớn để thu được càng nhiều photon từ nguồn càng tốt, cũng như tiêu cự ngắn để giảm thiểu diện tích của nguồn được chiếu vào hệ thống quang học của kính hiển vi. Do đó, để lấp đầy hoàn toàn tụ quang hoặc mặt phẳng tiêu cự bằng ánh sáng từ nguồn, quang học của kính hiển vi phải hoàn toàn phù hợp với tiêu cự, một tham số thường thay đổi khi vật kính mới được đưa vào chuỗi quang học. Ví dụ: với phương pháp chiếu sáng epi sử dụng vật kính có khẩu độ số cao 100 lần, hệ thống chiếu sáng Köhler có thể tạo ra hình ảnh cung tròn tương đối nhỏ và phân bố đều ở mặt phẳng tiêu cự phía sau. Tuy nhiên, vật kính có khẩu độ phía sau lớn hơn (chẳng hạn như 40x) có thể bị lấp đầy dưới mức đáng kể bởi cùng một cấu hình. Độ đồng đều của nguồn sáng có thể được tăng lên bằng cách chèn một tấm kính mờ giữa thấu kính thu và vật kính sao cho bề mặt kính phẳng trở thành nguồn sáng hiệu quả. Hành động này giải quyết vấn đề các photon bị tập trung ở các vị trí cách xa mặt phẳng khẩu độ, nhưng làm giảm đáng kể độ sáng của nguồn (tới 90%). Vì lý do này, tấm kính mờ chủ yếu chỉ được sử dụng với các nguồn ánh sáng truyền qua rất sáng chứ không phải khi cần mọi photon có thể để kích thích, như trường hợp huỳnh quang.
Với sự xuất hiện nhanh chóng của các nguồn chiếu sáng halogen kim loại bên ngoài như một lựa chọn tốt nhất cho kính hiển vi huỳnh quang, các ống dẫn ánh sáng và sợi quang đơn mode đang trở thành phương pháp được lựa chọn để ghép nguồn sáng với hệ thống quang học của kính hiển vi. Các hệ thống phân phối quang học này có tác dụng trộn hoặc xáo trộn ánh sáng phát ra từ đèn hồ quang, làm giảm hiệu quả sự kết hợp không gian và thời gian của nó để tạo ra trường chiếu sáng đồng đều. Chuyển động nhiệt trong ống dẫn ánh sáng lỏng liên tục làm thay đổi độ dài đường quang và tán xạ ánh sáng để loại bỏ sự kết hợp. Trong trường hợp sợi quang đơn mode cuộn, phản xạ lớp bọc liên tục thay đổi do sợi bị uốn cong một chút, tạo ra chùm tia thoát ra có cường độ đồng đều một cách hiệu quả theo thời gian và không gian. Kỹ thuật rung sợi quang (ở tần số lên tới 100 kilohertz) cũng có hiệu quả trong việc làm xáo trộn ánh sáng. Mặc dù tính kết hợp bị loại bỏ nhưng đặc tính bức xạ và bước sóng của nguồn vẫn được giữ nguyên.
Kết luận
Các đèn hồ quang hiện đang được sử dụng trong kính hiển vi huỳnh quang đủ sáng để bão hòa và tẩy quang tất cả các loại thuốc nhuộm huỳnh quang phổ biến. Khía cạnh yếu của các nguồn sáng này là khó kiểm soát nhanh các thông số vận hành đơn giản, chẳng hạn như cường độ và phân bố quang phổ. Bởi vì đèn hồ quang đã được cải tiến dần dần trong nhiều năm nên khó có khả năng đạt được bước nhảy vọt lớn về hiệu suất. Mặt khác, đèn hồ quang có hỗn hợp khí và vật liệu điện cực khác nhau liên tục được phát triển và sẽ tiếp tục cải tiến và gia tăng Tình huống tương tự đối với nguồn sáng vonfram-halogen. Nhìn chung, công nghệ đèn sợi đốt và đèn hồ quang cho kính hiển vi huỳnh quang có thể sẽ vẫn là những công nghệ quan trọng trong những năm tới,
Một trong những công nghệ mới nổi hứa hẹn nhất là điốt phát sáng. Đèn LED sở hữu tất cả các tính năng mong muốn mà đèn hồ quang thiếu và trong tương lai rất gần, chúng sẽ đủ hiệu quả để được cấp nguồn bằng pin điện áp thấp hoặc nguồn điện có thể chuyển đổi với chi phí rất thấp. Điểm yếu hiện tại của đèn LED là cường độ phát xạ biên của chúng, nhưng xu hướng phát triển cho thấy độ sáng sẽ tăng gấp ba lần trong vài năm tới. Những nỗ lực hiện đang được thực hiện để áp dụng các cơ chế tăng trưởng tiên tiến để tạo ra các tinh thể khuôn LED có hình dạng giúp giảm sự thất thoát ánh sáng thông qua các tạo tác phản xạ bên trong. Nếu nỗ lực này thành công, đèn LED sẽ có khả năng vượt trội trong tất cả các ứng dụng kính hiển vi huỳnh quang.
Các nhà sản xuất hậu mãi đang đóng vai trò ngày càng quan trọng trong việc phát triển các nguồn sáng độc lập để sử dụng trong kính hiển vi huỳnh quang. Ban đầu, các thiết bị phụ trợ này chủ yếu bao gồm các đèn chiếu sáng sợi quang thích hợp để sử dụng với kính hiển vi phẫu thuật, nhưng gần đây, các nguồn sáng tiên tiến thích hợp để sử dụng trong kính hiển vi huỳnh quang hiệu suất cao đã có sẵn. Ngoài việc ghép nối đèn hồ quang halogen kim loại tiên tiến với gương hình elip và bánh xe kính lọc tốc độ cao để dịch chuyển nhanh bước sóng đầu ra, những nguồn này còn cung cấp sợi quang hoặc dẫn hướng ánh sáng lỏng để ghép đầu ra với chuỗi quang học của kính hiển vi.
Nguồn:
Công ty Minh Khang là nhà phân phối độc quyền thị trường miền Nam phân khúc kính hiển vi hãng Carl ZEISS.
EN