Thierry Bonnevay (Microbiology Analytical Expert, Sanofi) & Laurent Leblanc (Microbiological R&D Manager, bioMérieux)

Giới thiệu

Hiện tại, ủ ở hai nhiệt độ là một trong những thực hành phổ biến nhất trong Giám sát Môi trường (EM). Tuy nhiên, ngày càng có nhiều sự quan tâm đến việc khám phá những lợi ích của phương pháp ủ mẫu một nhiệt độ được xác định rõ ràng. Trong thị trường công nghiệp luôn thay đổi và cạnh tranh cao, việc áp dụng chiến lược ủ ở một nhiệt độ không chỉ tăng cường hiệu quả quy trình cho các nhà sản xuất dược phẩm mà còn giảm thiểu nguy cơ sai sót do phương pháp ủ ở hai nhiệt độ gây ra.

Mục đích của tài liệu này là trình bày kết quả và giải thích phương pháp được sử dụng tại Sanofi (Khu vực Marcy l’Étoile – Pháp) để đánh giá tính phù hợp của nhiệt độ ủ duy nhất cho EM. Chúng tôi sẽ thảo luận về những thách thức của phương pháp ủ một môi trường / một nhiệt độ, với một nghiên cứu thực tế và đánh giá tính bền vững của chiến lược ủ ở một nhiệt độ cho EM.

Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu của nghiên cứu là tiến hành một thí nghiệm in vitro sơ bộ với các vi sinh vật tự nhiên / địa phương được phân lập để đánh giá việc sử dụng nhiệt độ ủ duy nhất cho các chương trình Giám sát Môi trường (EM).

Thiết kế nghiên cứu

Hai điều kiện khác nhau đã được so sánh:

• Hiện tại: ủ năm ngày ở 22,5°C + / – 2,5°C + hai ngày ở 32,5°C + / – 2,5°C → đọc kết quả cuối cùng + đọc kết quả trung gian.
• Phương án tối ưu: ủ bảy ngày ở 27,5°C + / – 2,5°C → đọc theo động học trên máy đọc đĩa Petri tự động (3P® STATION).

Máy ủ và đọc tự động

Máy ủ/ đọc 3P® STATION (xem hình A bên dưới) có khả năng ủ trong khoảng 20–35°C với độ chính xác + / – 1°C (xem hình B bên dưới). Hệ thống chụp ảnh từng đĩa mỗi giờ và theo dõi sự phát triển của vi sinh vật, phát hiện sự hiện diện của chúng từ kích thước CFU là 250μm.

Đồ thị tăng trưởng trong hình minh họa cung cấp thông tin về động học phát triển của vi sinh vật được kiểm tra. Hình ảnh bên phải là một ví dụ về Fusarium được thực hiện bởi 3P® STATION.

Các chủng được kiểm tra

Các chủng được kiểm tra bao gồm hai loại nấm men, tám loại nấm mốc và chín loại vi khuẩn từ các mẫu phân lập địa phương. Môi trường được thử nghiệm bao gồm Trypticase Soya Agar (TSA) với các chất trung hòa và đã được chiếu xạ. Số lần lặp lại là sáu đĩa cho mỗi chủng: ba đĩa trong điều kiện hiện tại so với ba đĩa trong điều kiện tối ưu.

Kết quả

Nhiệt độ ủ 27,5°C đã có tác động đáng kể lên Cladosporium, như quan sát thấy trong các hình ảnh bên dưới. Tuy nhiên, tất cả các vi sinh vật khác đều phát triển tốt, và có thể áp dụng một nhiệt độ ủ duy nhất. Ví dụ về các vi sinh vật không bị ảnh hưởng bởi chế độ nhiệt độ bao gồm Micrococcus luteus, Aspergillus fumigatus, Rhodotorula mucilaginosa và Penicillium chrysogenum, được hiển thị trong các hình ảnh dưới bảng chung.

Để hiểu rõ hơn về sự phát triển của Cladosporium, chúng tôi đã thực hiện các thử nghiệm bổ sung. Cladosporium là một trong ba loại nấm mốc hàng đầu (cùng với Penicillium và Aspergillus) được tìm thấy trong môi trường dược phẩm và có thể chiếm tới 27% số nấm mốc tìm thấy trong môi trường. Do đó, việc phát hiện Cladosporium không thể là những sự kiện hiếm gặp hoặc bị cô lập. Cladosporium có thể chiếm 20% tổng số nấm mốc tại các cơ sở của Sanofi Pasteur tại Pháp. Cladosporium là một trường hợp nghiên cứu tốt để thách thức tính phù hợp của việc áp dụng một nhiệt độ ủ duy nhất.

Cladosporium có thể phát triển ở 25–30°C, tuy nhiên đây rõ ràng không phải là nhiệt độ tối ưu và có nguy cơ cao không phát hiện được; khoảng 20–25°C là dải nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của nó.

Dựa trên dữ liệu này, chúng tôi quyết định đánh giá tác động của nhiệt độ ủ 27,5°C đối với sự phát triển của một nhóm Cladosporium lớn hơn. Chúng tôi đã chọn năm loại Cladosporium khác nhau (C. subuliforme, C. pseudocladodosporoides, C. cladosporoides, C. sphaerospermum, và C. herbarum) từ ngân hàng tế bào của bioMérieux, nơi chứa hơn 36.000 vi sinh vật khác nhau.

Tất cả các chủng này đều được phân lập từ môi trường dược phẩm. Theo cùng một quy trình, chúng tôi đã so sánh động học phát triển giữa việc ủ ở 22,5°C và 27,5°C, trong đó tỷ lệ phục hồi được tính toán và hình thái của các CFU trên đĩa Petri được kiểm tra.

Thảo luận

Có thể quan sát thấy tác động rõ ràng của nhiệt độ ủ đối với Clostridium herbarum. Mặc dù các chủng khác được thử nghiệm cho thấy tỷ lệ phục hồi thỏa đáng, nhưng sự tạo bào tử có thể xảy ra. Những kết quả này xác nhận Cladosporium là một tế bào không tối ưu khi thử nghiệm ở 27,5°C, nhưng đây có thể là một nhiệt độ tối ưu nếu dữ liệu từ các loại nấm mốc đại diện trong môi trường dược phẩm không cho thấy tác động tiêu cực.

Một câu hỏi bổ sung: liệu nhiệt độ thấp hơn (ví dụ: 25°C) có hỗ trợ tốt cho sự phát triển của tất cả các vi sinh vật trong Giám sát Môi trường (EM) hay không? Để kiểm tra điều này, một nghiên cứu khác đã được tiến hành.

Nghiên cứu mới ở 25°C

Theo cùng một quy trình, các nhiệt độ mới được thử nghiệm là 22,5°C và 25°C. Nhiệt độ 25°C được sử dụng để tiếp tục điều tra những giới hạn trong sự phát triển của nấm mốc (bao gồm các chủng Cladosporium) và được đánh giá trên máy ủ 3P® STATION. Nhiệt độ 22,5°C được sử dụng để đánh giá sự phát triển của các loại vi khuẩn khó khăn có nhiệt độ phát triển tối ưu cao hơn, và được đánh giá trong máy ủ truyền thống. Tổng cộng 36 vi sinh vật đã được thử nghiệm.

Lựa chọn chủng vi khuẩn

Một nhóm các chủng vi khuẩn dại đại diện từ môi trường dược phẩm được chọn theo dải nhiệt độ phát triển của chúng.

Việc chọn lọc nấm bao gồm Candida glabrata, Aspergillus fumigatus, Penicillium chrysogenum, Cladosporium sp. (tại các địa điểm Neuville và Marcy l’Étoile), Cladosporium herbarum (tại địa điểm Val de Reuil), và Cladosporium halotolerans (tại địa điểm Marcy l’Étoile).

Kết quả của FUNGI (25°C VS. 22.5°C)

Tất cả tỷ lệ phục hồi đều đạt yêu cầu trong phạm vi quy định 50–200%. Tất cả các loài Cladosporium được thử nghiệm đều cho thấy sự phát triển thỏa mãn ở nhiệt độ 25°C

Kết quả của vi khuẩn (22.5°C VS. 25°C)

Tất cả tỷ lệ phục hồi đều phù hợp với yêu cầu trong phạm vi 50–200%. Tất cả các loài Cladosporium được thử nghiệm đều phát triển ở nhiệt độ 25°C.

Lựa chọn các vi sinh vật

Thêm 18 chủng nấm đã được thử nghiệm. Các chủng nấm từ dược điển (được in đậm trong bảng trên) từ bộ sưu tập môi trường nuôi cấy và các chủng nấm tự nhiên từ ngân hàng chủng nấm của bioMérieux

Kết quả của FUNGI (25°C VS. 22.5°C)

Tất cả tỷ lệ phục hồi đều phù hợp với yêu cầu trong phạm vi 50–200%. Tất cả các loài nấm được thử nghiệm đều phát triển ở nhiệt độ 25°C. Không quan sát thấy sự thay đổi về hình thái trên Cladosporium

Kết quả của vi khuẩn (22.5°C VS. 25°C)

Như đã trình bày trong bảng trên, Corynebacterium striatum cho thấy tỷ lệ phục hồi hơi thấp hơn yêu cầu. Các loại vi khuẩn khác phát triển trong phạm vi yêu cầu ở nhiệt độ 22,5°C.

Nghiên cứu bổ sung: Kết quả của vi khuẩn (22.5°C VS. 32.5°C)

Một nghiên cứu bổ sung đã được thực hiện để so sánh sự phát triển của C. striatum giữa 22,5°C và 32,5°C trên môi trường TSA, thực hiện ba lần lặp lại.

Tỷ lệ phục hồi phù hợp với yêu cầu 50–200% của USP. Tuy nhiên, ở 22,5°C, không quan sát thấy sự phát triển rõ ràng sau 72 giờ. C. striatum bắt đầu phát triển sau 96 giờ nhưng vẫn rất nhỏ. Chỉ sau bảy ngày ủ, mới có thể thực hiện việc đếm số lượng một cách đơn giản hơn

Kết luận

Nghiên cứu này chứng minh rằng việc sử dụng ủ mẫu một nhiệt độ cho EM là khả thi. Thời gian ủ mẫu cũng là một yếu tố quan trọng.

Dải nhiệt độ được chứng minh là phù hợp cho ủ mẫu EM nằm trong khoảng từ 25°C đến 30°C. Nhiệt độ 25°C cho phép phát hiện tất cả các vi sinh vật với thời gian ủ là bảy ngày. Nhiệt độ 27,5°C có thể được sử dụng khi ủ trong năm ngày, nhưng cần lưu ý rằng Cladosporium herbarum có thể khó phát hiện.

Nhiệt độ được chọn nên được xác nhận để đảm bảo sự phát triển đầy đủ cho các vi sinh vật khó nuôi cấy, như Cladosporium, khi sử dụng nhiệt độ quá cao và Corynebacterium khi nhiệt độ quá thấp.

Tự động hóa quá trình ủ và đọc đĩa Petri là cơ hội để giảm thời gian ủ mẫu (một đến hai ngày) sau khi đã thu thập đủ dữ liệu.

Nguồn:

Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các Thiết bị giám sát môi trường hãng BioMérieux.