Tăng năng suất trên Krios G4 Cryo-TEM với hình ảnh không bị nhiễu sợi

Electrons có thể được mô tả là cả hạt và bước sóng. Trong cột kính hiển vi, khi electron đi qua một lỗ mở nhỏ như khẩu độ tụ quang (C2), chúng bị nhiễu sáng ở vạch khẩu độ và sự nhiễu sóng dẫn đến sự xuất hiện của các sợi nhiễu Fresnel (Hình 1A)

Hình 1. Hình ảnh không có sợi nhiễu. A) Khẩu độ C2 khuếch tán tia electron và tạo ra các sợi nhiễu Fresnel. B) Hình ảnh của tia với khẩu độ C2 không được tập trung. Nhiều sợi nhiễu Fresnel có thể nhìn thấy. C) Hình ảnh của tia với khẩu độ C2 được tập trung. Không có sợi nhiễu Fresnel nào có thể nhìn thấy.

Hình 2. Ví dụ về cách FFI tăng hiệu suất thu thập dữ liệu. A) Thiết lập thí nghiệm cho lưới R 1.2/1.3. Thiết lập không sử dụng FFI (khẩu độ C2 30 μm) chỉ cho phép một khu vực phơi sáng trong khi thiết lập sử dụng FFI (khẩu độ C2 20 μm) cho phép hai khu vực. Cả hai đều sử dụng kích thước pixel khoảng 0.57 Å/pix. B) Tỷ lệ hiệu suất thu thập dữ liệu cho máy ảnh Falcon 4i sử dụng ở 0.57 Å, 8 epx và 40 e/A2 đang giảm thời gian phơi sáng khi kết hợp với FFI và AFIS.

Để giảm thiểu sự xuất hiện của các sợi nhiễu Fresnel trong hình ảnh ghi lại, vị trí bàn soi cần được điều chỉnh để đưa mẫu vào mặt hình ảnh của khẩu độ C2 được tạo ra bởi điểm trên của cực cảnh OBL. Sức mạnh của điểm dưới của cực cảnh OBL được điều chỉnh để mẫu được tập trung trên mặt phẳng hình ảnh của máy ảnh. Với cài đặt này, cả khẩu độ C2 và mẫu sẽ được tập trung và không có hoặc rất ít các sợi nhiễu Fresnel sẽ được nhìn thấy trong hình ảnh được ghi lại bởi máy ảnh (Hình 1C). Điều này cho phép giảm kích thước của tia và thu được nhiều hình ảnh hơn từ một khẩu độ mở duy nhất (Hình 2A).

Kích thước tia nhỏ hơn được tạo ra bởi FFI tạo ra nhiều hình ảnh hơn từ một khẩu độ duy nhất có thể được ghi lại. Điều này cho phép sử dụng hiệu quả hơn của bề mặt lưới có sẵn cho việc hình ảnh hóa. Ngoài ra, sự tăng diện tích chiếu sáng cho mỗi khẩu độ cải thiện tốc độ thu thập dữ liệu bằng cách giảm số lần di chuyển sân đạp (bao gồm cả thời gian lắng đọng) và tự động lấy nét phải được thực hiện trong quá trình thu thập dữ liệu. Sự tăng hiệu suất chính xác phụ thuộc vào một số biến số như kích thước và khoảng cách của khẩu độ trên lưới, loại máy ảnh và tỉ lệ phóng đại. Sự kết hợp của FFI với việc dịch chuyển hình ảnh không lỗi sai (AFIS) cung cấp sự tăng hiệu suất cao nhất so với một kế hoạch thu thập dữ liệu tiêu chuẩn (Hình 2).

Trong lý thuyết, FFI có thể được đạt được bằng cách sử dụng bất kỳ kính hiển vi nào bằng cách điều khiển động cơ sân đạp để thay đổi độ cao mẫu và điều chỉnh mức mất tập trung của mẫu. Tuy nhiên, điều này có nghĩa là mẫu sẽ không còn ở độ cao eucentric nữa. Sự điều chỉnh FFI cho Thermo Scientific™ Krios G4™ Cryo-TEM là một điều chỉnh cơ khí của bàn soi: toàn bộ bàn soi được hạ xuống đến độ cao Z cần thiết bằng cách sử dụng đế nghiêng. Trục nghiêng và độ cao eucentric được điều chỉnh lại để hoạt động một cách tối ưu ở vị trí sân đạp đó. Điều này cho phép thu thập dữ liệu từng hạt đơn và dữ liệu tomography một cách liền mạch với FFI.

Khả năng tương thích

FFI chỉ hoạt động trong chế độ hình ảnh TEM nano (nP). Nó không hoạt động với chế độ microprobe (µP) vì ống kính mini-condenser ảnh hưởng đến vị trí hình ảnh của khẩu độ C2 và không cho phép FFI.Các việc điều chỉnh FFI trên Krios G4 Cryo-TEM được thực hiện ở các phóng đại SA trung bình cao, với một phóng đại cho kết quả pixel có khoảng 0.9Å/pixel. Các phạm vi phóng đại khác (LM, Mi, Mh) không thể sử dụng với FFI vì chúng không đáp ứng các điều kiện cho FFI. Tuy nhiên, các ứng dụng như phân tích từng hạt đơn và tomography không bị ảnh hưởng bởi điều này vì chúng yêu cầu phóng đại SA trung bình cao hoạt động tốt với FFI. Khi sử dụng thêm defocus với OBL, defocus như vậy cũng sẽ thay đổi tiêu cự của khẩu độ C2 và giới thiệu một số sợi nhiễu xung quanh vạch tia. Tuy nhiên, các giá trị defocus thường được sử dụng trong các thí nghiệm SPA (1 đến 4 μm) có tác động hạn chế đối với sợi nhiễu và sẽ không làm trở ngại cho ứng dụng FFI.

Các phương pháp

Nếu hệ thống TEM có các điều chỉnh FFI được thực hiện và các hiệu chỉnh liên quan đã được hoàn thành, thì nó sẵn sàng sử dụng ngay lập tức. Tuy nhiên, FFI có một số khác biệt so với chiếu sáng TEM thông thường. Với FFI trên hệ thống Krios G4 Cryo-TEM, sử dụng ba tụ quang, đường kính của tia electron có thể được làm nhỏ đến 550 đến 600 nm trong chế độ Nanoprobe để cho phép thu được nhiều hình ảnh hơn mỗi khẩu độ so với hệ thống Thermo