TÓM TẮT: Ferritin là một loại protein dự trữ sắt phổ biến được sử dụng làm vật liệu nano để gắn nhãn các phân tử sinh học và cấu trúc hạt nano. Các chế phẩm chứa ferritin như lá lách ngựa, được sử dụng phổ biến làm nguyên liệu ban đầu, chứa sự phân bố ferritin với tải lượng sắt khác nhau. Bài viết mô tả một cách tiếp cận chi tiết để tăng nồng độ ferritin bằng các kỹ thuật sinh lý thông thường như sắc ký loại trừ kích thước và siêu ly tâm chuẩn bị, đồng thời mô tả đặc điểm của các chế phẩm này bằng tán xạ ánh sáng động và siêu ly tâm phân tích. Bài viết cũng chứng minh sự kết hợp của các phương pháp để chuẩn hóa cách xác định tải lượng hóa học của hầu hết mọi hạt, bao gồm cả hạt nano và keo hạt kim loại. Việc tinh chế và mô tả đặc tính hàm lượng sắt trong các loại ferritin đơn phân tán là đặc biệt quan trọng đối với một số ứng dụng trong khoa học vật liệu nano.

GIỚI THIỆU

Sắt là một yếu tố thiết yếu cho con người, được lưu trữ trong protein ferritin phổ biến và có khả năng bảo tồn cao. Protein đóng một vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa sắt và khả năng cô lập nguyên tố này cho phép ferritin trở nên cần thiết để giải độc và dự trữ sắt. Việc chuyển hóa sắt rất quan trọng đối với nhiều quá trình sinh học và sự sai lệch dẫn đến nhiều tình trạng bệnh tật.

Ferritin là một protein dự trữ sắt phân bố ở nồng độ cao ở gan và lá lách nhưng cũng được tìm thấy ở tim và thận. Ferritin từ tất cả các loài có 24 tiểu đơn vị protein được sắp xếp theo đối xứng 4,3,2 để tạo thành phức hợp hình cầu và rỗng với khoang có đường kính khoảng 8 nm có khả năng lưu trữ tới 4500 nguyên tử sắt. Vỏ protein có độ bảo toàn cao với khối lượng mol tổng hợp khoảng 500 kDa, và cả dạng apo và dạng chứa sắt đều được đặc trưng bởi một loạt các xét nghiệm quang phổ, tinh thể và sinh hóa để xác định cấu trúc và chức năng của chúng. Những nỗ lực nghiên cứu về ferritin cũng tập trung vào cơ chế và quy định của nó ở tình trạng bệnh tật.

Phần lớn nghiên cứu gần đây về ferritin đã chuyển từ mối quan hệ cấu trúc-chức năng cơ bản sang mô hình hạt nano để phân tích tải lượng kim loại và hỗn hợp keo, vì lồng protein của ferritin đã được chứng minh là hữu ích như một vật chứa vô số khoáng chất của các kim loại khác bao gồm cả gadolinium , chì, cadmium, niken, coban, crom và vàng. Ferritin gần đây cũng đã được sử dụng để tạo ra các hạt nano dựa trên magiê, coban và đồng cho các thiết bị điện tử có đặc tính dẫn điện và từ tính. Tuy nhiên, ngày càng rõ ràng rằng việc kiểm soát kích thước và lượng khoáng chất là rất quan trọng đối với việc chế tạo vật liệu nano như các thiết bị bộ nhớ và để dán nhãn huỳnh quang cho các phân tử sinh học.

Bài viết mô tả một phương pháp tiêu chuẩn hóa để xác định hàm lượng tối đa của một số nguồn ferritin bằng cách tinh chế protein đơn phân bằng sắc ký loại trừ kích thước, xác định kích thước bằng tán xạ ánh sáng động, phân lập các loài được nạp tối đa bằng cách ly tâm chuẩn bị, và cuối cùng, xác định khối lượng bằng tốc độ lắng và siêu ly tâm phân tích cân bằng trầm tích. Bài viết cũng trình bày các quy trình để cải thiện tính đồng nhất của kích thước lõi bằng cách sử dụng siêu ly tâm chuẩn bị Gradient Sucrose.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

ĐẶC TÍNH CỦA MONOMERIC FERRITIN VÀ APOFERRITIN

Ferritin (màu đỏ) và apoferritin (màu xanh) từ Sigma-Aldrich chịu sự tán xạ ánh sáng động (A) và tốc độ lắng (B) tương ứng với kích thước và hệ số lắng. Cả ferritin và apoferritin đều có vẻ đồng nhất bởi DLS nhưng ferritin không đồng nhất do tải trọng sắt được thăm dò bằng siêu ly tâm phân tích.

PHÂN TÍCH VÀ ĐẶC ĐIỂM CỦA FERRITI ĐƯỢC NẠP

Độ hấp thụ của từng phần được đo đối với apoferritin (màu xanh) và ferritin đơn phân (màu đỏ) sau khi ly tâm ở tốc độ 38.000 vòng/phút trong 2,5 giờ trên rôto SW40Ti ở gradient sucrose 5%-30% (w/v) (A). Các phần ferritin được chọn sau đó được đặc trưng bởi tốc độ lắng sau khi sắc ký loại trừ kích thước. Biểu đồ cho mức 5 (cam), 8 (vàng đậm), 11 (xanh lam), 14 (đỏ) và 17 (xanh lá cây) được hiển thị, cùng với dữ liệu về apoferritin (màu xanh lam, biểu đồ tỷ lệ) và ferritin đơn phân không phân đoạn (đường màu đen nét đứt) ) (B). Mức 17 của ferritin từ gradient sucrose được phân tích bằng tốc độ lắng và cấu hình c(s). Ferritin được nạp đầy đủ có hệ số lắng là 60S (C).

XÁC ĐỊNH NGUỒN FERRITIN

Để xác nhận kết quả từ một nguồn bổ sung, một lô ferritin lá lách ngựa mới đã được mua từ Amersham. Khoảng 5 mg apoferritin chưa tinh khiết (màu xanh), 2,7 mg ferritin Sigma-Aldrich (màu đỏ) chưa tinh khiết và 5 mg Amersham ferritin (màu xanh lá cây) được phân giải bằng sắc ký loại trừ kích thước. Các loài rửa giải ở 110 phút đại diện cho các thành phần đơn phân (A). Mẫu Amersham dường như chứa ít kết tụ hơn mẫu Sigma-Aldrich. Phân đoạn gradient Sucrose được lặp lại trên các mẫu Amersham bằng cách sử dụng cùng một giao thức như đối với ferritin Sigma-Aldrich. Sau khi phân đoạn, loại trừ kích thước được thực hiện trên các mức 14 (đỏ), 15 (xanh dương), 16 (xám) và 17 (xanh lục) (B). Các phần được rửa giải đồng nhất dưới dạng monome.

Amersham ferritin (màu đỏ) và Amersham ferritin đơn phân được tinh chế bằng cách loại trừ kích thước (màu xanh) cho các cấu hình c(s) (A). Sau khi phân đoạn gradient sucrose, các mức Amersham 14 (đỏ), 15 (xanh lam), 16 (xám) và 17 (xanh lục) đã được xử lý SAUUC và biểu thị lại cho c(s).

 

XÁC ĐỊNH THỂ TÍCH ĐẶC BIỆT VÀ KHỐI LƯỢNG MOL

Giả định rằng loài này có cùng kích thước và hình dạng với apoferritin và f/fo cố định là 1,27 để ước tính khối lượng mol; giá trị cho thể tích riêng từng phần đã được tinh chỉnh trong phân tích dữ liệu trả về khối lượng mol là 890 kDa. Sau đó, các phép tính đơn giản được sử dụng để xác định tải lượng sắt và khối lượng của lõi sắt được tính ở mức 410±20 kDa bằng cách trừ khối lượng apoferritin khỏi khối lượng ferritin được nạp tối đa, phù hợp tốt với dữ liệu tán xạ tia X trước đó.

 

Các thí nghiệm cân bằng trầm tích cũng được thực hiện để xác định thêm khối lượng mol của các phần apoferritin 17 S (A) và 70 S Amersham ferritin (B). Như trong các thí nghiệm về vận tốc lắng đọng, dữ liệu cân bằng lắng đọng được thu thập ở nhiều nồng độ phù hợp với sự hiện diện của một loài duy nhất. Đường phù hợp nhất cung cấp các giá trị của điểm chặn và độ dốc để xác định thông số thể tích riêng và hydrat hóa. Khối lượng mol nổi quan sát được giảm tuyến tính khi mật độ dung dịch tăng lên cho thấy sự hiện diện của hạt không đổi.

 

 

Một bảng tóm tắt dữ liệu thu được từ cả tốc độ lắng và trạng thái cân bằng lắng khi chạy trên apoferritin và cả hai nguồn ferritin sau quá trình phân đoạn từ gradient sucrose.

KẾT LUẬN

Các hạt nano thường xuyên được nạp các gốc hóa học để xác định tải trọng tối đa của các hạt. Bài viết này đã trình bày tiêu chuẩn hóa một phương pháp để tinh chế và xác định đặc tính của quần thể ferritin đồng nhất để xây dựng vật liệu nano. Bên cạnh đó, chỉ ra cách kết hợp giữa sắc ký, tán xạ ánh sáng động và AUC có thể khắc phục những hạn chế của các xét nghiệm sinh hóa khác như ELISA không thể phân biệt giữa ferritin và apoferritin. Sử dụng phương pháp tiêu chuẩn hóa này, các nhà nghiên cứu có thể chứng minh chính xác hơn số lượng thực thể liên hợp với một hạt quan tâm cụ thể trước khi thử nghiệm lâm sàng.

Nguồn:

Minh Khang là nhà nhập khẩu và phân phối trực tiếp các thiết bị ly tâm hãng Beckman Coulter.