Giới thiệu

Những tiến bộ công nghệ trong Giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) đã cho phép các nhà nghiên cứu thu thập thông tin về chức năng và cấu trúc của bộ gen và bản phiên mã. Giải trình tự sâu các vùng mã hóa và không mã hóa của bộ gen trên một số lượng lớn mẫu là một phương pháp phổ biến ở nhiều phòng thí nghiệm nghiên cứu. Các nhà nghiên cứu có thể phát hiện cơ sở di truyền của các điều kiện sinh học khác nhau một cách đáng tin cậy nhờ vào phạm vi phủ sóng rộng do NGS cung cấp

Tuy nhiên, có một số rào cản đối với việc phát hiện chính xác các tình trạng di truyền, một trong số đó là thông lượng mẫu. Các công nghệ giải trình tự hiện tại yêu cầu chuẩn bị mẫu chuyên dụng để tạo thư viện giải trình tự được tải vào thiết bị. Tùy thuộc vào thông lượng yêu cầu và loại trình tự, việc chuẩn bị thư viện có thể phức tạp khi thực hiện thủ công. Tự động chuẩn bị thư viện NGS cho phép sử dụng các giao thức phức tạp trong các thử nghiệm thông lượng cao. Ngoài ra, tự động hóa mang lại khả năng tái sản xuất cao, giảm tỷ lệ lỗi và giảm ô nhiễm do sự tương tác tối thiểu của con người. Bất chấp những ưu điểm này, không phải tất cả quy trình làm việc tự động đều giống nhau. Do đó, Beckman so sánh bộ xử lý chất lỏng truyền thống với Hệ thống chuẩn bị thư viện thế hệ mới Biomek NGeniuS, một bộ xử lý chất lỏng được thiết kế có mục đích để chuẩn bị thư viện NGS. Để so sánh, Beckman sử dụng giao thức Roche KAPA HyperPrep tự động, với thông lượng 24 mẫu (Hình 1, Bảng 1).

Tự động hóa quy trình NGS: So sánh giữa Bộ xử lý chất lỏng truyền thống và Hệ thống chuẩn bị thư viện thế hệ mới Biomek NGenuS

Tính năng phương pháp tự động	Hệ thống Biomek NGenuS	Xử lý chất lỏng truyền thống
Thiết lập phương pháp	Thư viện miễn phí gồm các phương pháp trình dữ liệu, không cần lập trình	Người dùng phải viết hoặc mua phương thức chứng minh dữ liệu
	Phương pháp có thể được thiết lập bên ngoài trang web	Phương pháp thiết lập được thực hiện tại thiết bị
	Đồng bộ hóa tối đa 50 nhạc cụ	Không đồng bộ hóa
	Các cấp độ ủy quyền người dùng khác nhau	Các cấp độ ủy quyền người dùng khác nhau
	Hỗ trợ công việc theo lô cụ thể có thể in được	Không có
Sự phân mảnh	ngoại tuyến	ngoại tuyến
Chia mẫu	Mẫu trong Bình phản ứng 24 giếng đa năng (RV)	24 mẫu trong đĩa 96 giếng
Xác thực thiết lập lớp chất lỏng	Dynamic DeckOptix	Thủ công
Chuẩn hóa	tự động	Tính toán và lập trình thủ công (24 bước pipet thủ công)
End Repair và A-Tailing	Trên lớp chất lỏng, ủ trong máy luân nhiệt	Ủ ngoài, tích hợp trên lớp chất lỏng tùy chọn
Ligation	Trên lớp chất lỏng, ủ trong máy luân nhiệt	Ủ ngoài, tích hợp trên lớp chất lỏng tùy chọn
PCR	Trên lớp chất lỏng	Tích hợp ngoài, tùy chọn trên lớp chất lỏng
Làm sạch	Tự động hóa, sử dụng trạm trên lớp chất lỏng	Tự động hóa bằng đĩa nam châm
Giám sát trạng thái hệ thống	Tại chỗ: Thanh ánh sáng nhiều màu 360° ở trên cùng, Ngoại vi: Phần mềm Cổng thông tin Biomek NGenuS	Tại chỗ: thông qua phần mềm

Bảng 1. Tự động hóa giao thức Roche KAPA HyperPrep, hệ thống Biomek NGeniuS so với bộ xử lý chất lỏng truyền thống.

Thiết lập phương pháp

Không giống như các hệ thống truyền thống, hệ thống Biomek NGeniuS đi kèm với một bộ sưu tập miễn phí các phương pháp xây dựng thư viện NGS được minh họa bằng dữ liệu. Chúng bao gồm các phương pháp Giải trình tự DNA (Toàn bộ bộ gen và Sắp xếp lại trình tự có mục tiêu) và Giải trình tự RNA (mRNA, RNA tổng số, RNA mục tiêu). Thư viện ứng dụng được thiết kế để phát triển theo nhu cầu thay đổi của khách hàng. Từ thư viện ứng dụng Biomek NGeniuS, người dùng có thể chọn phương thức mong muốn để chạy và nhập các tham số phương thức liên quan của bộ công cụ (Hình 2). Phần mềm cho phép người dùng chọn các điểm dừng an toàn được nhà cung cấp thuốc thử khuyến nghị. Người dùng có thể đồng bộ hóa đồng thời lên tới 50 hệ thống Biomek NGeniuS trên một mạng, mang lại sự linh hoạt để mở rộng phòng thí nghiệm. Người quản lý phòng thí nghiệm cũng có khả năng thiết lập các ủy quyền người dùng khác nhau để cung cấp các cấp độ truy cập cụ thể cho nhiều người dùng khác nhau. Quá trình thiết lập chạy trên Hệ thống chuẩn bị thư viện thế hệ tiếp theo Biomek NGeniuS không yêu cầu bất kỳ kỹ năng lập trình nào và có thể được thực hiện từ mọi nơi bằng cách sử dụng máy tính hỗ trợ Google Chrome hoặc Microsoft Edge. Để so sánh, các bộ xử lý chất lỏng truyền thống yêu cầu người dùng lập trình phương pháp bằng phần mềm thiết bị, thường là tại chỗ.
Sau khi các tùy chọn phương pháp được chọn, phần mềm Biomek NGeniuS sẽ tự động tính toán lượng thuốc thử cần thiết để hoàn tất quá trình chạy. Sau đó, người dùng có thể tạo trợ giúp công việc theo lô cụ thể trong đó liệt kê các thuốc thử cần thiết cho lô đó. Điều này có nghĩa là người dùng biết chính xác những gì cần thiết cho quá trình chạy, ngay cả trước khi vào phòng thí nghiệm.

Giao thức Roche KAPA HyperPrep: Phân mảnh

Giao thức Roche KAPA HyperPrep chuẩn bị các thư viện DNA sẵn sàng giải trình tự. Quy trình bắt đầu bằng việc phân mảnh cơ học các mẫu DNA để đạt được các đoạn có kích thước 180 – 220 bp (Hình 1). Cả hai giao thức xử lý chất lỏng đều thực hiện phân mảnh ngoài boong bằng công cụ Covaris (Covaris, Woburn, MA).

Giao thức Roche KAPA HyperPrep: Chia mẫu

Cả hai giao thức thiết bị đều yêu cầu chia nhỏ DNA đã cắt thủ công vào dụng cụ thí nghiệm thân thiện với tự động hóa. Ngay cả khi người dùng đang chạy 24 mẫu, bộ xử lý chất lỏng truyền thống vẫn yêu cầu đĩa mẫu 96 giếng. Ngược lại, hệ thống Biomek NGeniuS sử dụng Bình phản ứng 24 giếng (RV) làm đĩa đầu vào (Hình 3). RV đóng vai trò là đĩa mẫu với tối đa 100 triệu mã vạch duy nhất cho ID dương tính của mẫu. Phương pháp NGS điển hình là nặng về dụng cụ thí nghiệm, cần ít nhất 3 loại đĩa khác nhau (ví dụ: đĩa đầu vào mẫu chứa mẫu axit nucleic, đĩa PCR để luân nhiệt và đĩa giếng sâu để làm sạch). Bình phản ứng Biomek NGenuS thay thế cả ba loại đĩa, giảm nhu cầu quản lý nhiều hàng tồn kho tiêu hao, tiết kiệm thời gian và chi phí

Giao thức Roche KAPA HyperPrep: Chia nhỏ thuốc thử

Tự động hóa trên bộ xử lý chất lỏng truyền thống yêu cầu tất cả các thuốc thử cần thiết phải được phân chia thủ công vào các ống thân thiện với tự động hóa (ví dụ: đối với thuốc thử thể tích nhỏ như enzyme) hoặc vào bình chứa (ví dụ: đối với thuốc thử thể tích lớn như ethanol). Điều quan trọng nữa là phải đảm bảo rằng tất cả các ống đều thuộc cùng một loại. Vì bộ thuốc thử có nhiều loại ống khác nhau nên người dùng phải chia nhỏ thuốc thử theo cách thủ công từ các ống ban đầu sang các ống thân thiện với máy tự động. Ngoài ra, thuốc thử nhạy với nhiệt độ phải được đặt trên Peltier lạnh có khối lạnh. Vì các thành phần phần cứng này không được bao gồm trong cấu hình thiết bị nên người dùng phải mua riêng chúng với một khoản phụ phí.

Để so sánh, giao thức Hệ thống chuẩn bị thư viện thế hệ tiếp theo của Biomek NGenuS loại bỏ các bước hút mẫu không cần thiết này bằng cách yêu cầu người dùng đặt các ống thuốc thử gốc trên băng chuyền đầu vào thuốc thử (Hình 4). Băng chuyền tương thích với nhiều ống công nghiệp, do đó làm giảm nhu cầu chuyển thuốc thử sang đĩa. Với công nghệ nhận dạng ký tự quang học tiên tiến, hệ thống có thể tự động xác định thuốc thử nào được nạp vào băng chuyền và ống cần thiết nào bị thiếu (có hoặc không có mã vạch). Nó giảm thiểu chất thải do sử dụng không đúng mức thuốc thử đã mạ và mang lại sự linh hoạt khi chạy bất kỳ cỡ lô nào từ 4 – 24 mẫu. Hộp pipet LLS (Cảm biến mức chất lỏng) 8 kênh Biomek NGeniuS phát hiện không đủ thuốc thử trước khi chạy. Thuốc thử nhạy với nhiệt độ được đặt trong khu vực bảo quản lạnh Biomek NGenuS (2-65 °C).

Giao thức Roche KAPA HyperPrep: Xác thực thiết lập lớp chất lỏng

Việc tự động hóa giao thức KAPA HyperPrep trên bộ xử lý chất lỏng truyền thống yêu cầu người dùng quét cẩn thận bộ kiểm tra để đảm bảo tất cả thuốc thử được đặt vào đúng vị trí bộ kiểm tra, đồng thời kiểm tra các loại và điều kiện của dụng cụ phòng thí nghiệm (ví dụ: các ống có nắp) trước khi bắt đầu chạy tự động. Ngược lại, hệ thống Biomek NGeniuS Dynamic DeckOptix quét bộ bài để xác định các lỗi thiết lập phổ biến (Hình 5). Sử dụng phân tích quang học phức tạp và màn hình hiển thị 24 inch, Dynamic DeckOptix cung cấp phản hồi theo thời gian thực về vị trí đặt dụng cụ thí nghiệm để loại bỏ hầu như các lỗi tải. Phần mềm có thể xác định các tình trạng của dụng cụ thí nghiệm như ống thuốc thử bị bung nắp, RV đầu vào mẫu không chính xác, nắp đĩa đặt sai vị trí, thiếu miếng đệm luân nhiệt. Hệ thống này cũng cho phép người dùng sử dụng một phần hộp tip trong phương pháp. Bằng cách sử dụng phân tích quang học, hệ thống sẽ tự động đếm số lượng còn lại trong hộp và xác định xem có đủ để hoàn thành quy trình làm việc mong muốn hay không.

Giao thức Roche KAPA HyperPrep: Chuẩn hóa

Chuẩn hóa trong quy trình NGS đề cập đến quá trình cân bằng nồng độ axit nucleic. Giao thức xử lý chất lỏng truyền thống yêu cầu người dùng thực hiện chuẩn hóa theo cách thủ công, bằng cách tính toán khối lượng cần thiết và lập trình lại bộ xử lý chất lỏng. Ngược lại, giao thức hệ thống Biomek NGeniuS có bước chuẩn hóa tự động để giảm thêm thời gian thực hiện.

Giao thức Roche KAPA HyperPrep: End Repair và A-Tailing

Cả hai bộ xử lý chất lỏng đều tự động hóa quá trình thiết lập phản ứng End Repair và A-Tailing. Bộ xử lý chất lỏng truyền thống yêu cầu tích hợp máy luân nhiệt để thực hiện phản ứng ủ. Trong trường hợp không tích hợp, người dùng phải lấy đĩa ra, thực hiện phản ứng trong một máy chu trình nhiệt riêng biệt và mang tấm trở lại bộ xử lý chất lỏng để thực hiện bước tiếp theo. Điều này đòi hỏi sự can thiệp của người dùng và thời gian thực hiện đáng kể. Với hệ thống Biomek NGeniuS, quá trình ủ End Repair và A-Tailing được thực hiện trong hệ thống vận chuyển dụng cụ thí nghiệm và máy điều nhiệt tích hợp (Gripper; Hình 6). Điều này làm tăng thời gian thực hiện và giảm thiểu tương tác thủ công với bộ xử lý chất lỏng.

Giao thức Roche KAPA HyperPrep: Ligation

Cả hai giao thức đều tự động hóa việc thiết lập phản ứng Ligation bộ chuyển đổi. Bộ xử lý chất lỏng truyền thống yêu cầu tích hợp máy điều nhiệt để ủ trên lớp chất lỏng. Để so sánh, hệ thống Biomek NGeniuS có hệ thống vận chuyển thiết bị thí nghiệm và máy luân nhiệt tích hợp để tự động hóa quá trình ủ và chu trình nhiệt mà không cần tích hợp thêm phần cứng và phần mềm (Hình 6).

Giao thức Roche KAPA HyperPrep: PCR

Như trong trường hợp ủ End repair/A-tailing và ligation, bộ xử lý chất lỏng truyền thống yêu cầu một máy luân nhiệt tích hợp cho PCR. Ngược lại, hệ thống Biomek NGeniuS có bộ chu trình nhiệt tích hợp, cho phép người dùng thoát khỏi quá trình chạy tự động sau khi quá trình chạy bắt đầu (Hình 6). Hệ thống Biomek NGenuS có bộ kẹp tích hợp để vận chuyển dụng cụ thí nghiệm nhằm giảm thiểu sự tương tác với hệ thống. Nếu không có máy luân nhiệt, bộ xử lý chất lỏng truyền thống yêu cầu sáu lần tương tác của người dùng với hệ thống

Trong khi phương pháp xử lý chất lỏng truyền thống yêu cầu đĩa PCR được phủ hoàn toàn để thực hiện chu trình nhiệt thì quy trình làm việc của Biomek NGenuS không yêu cầu loại phần mềm phòng thí nghiệm cụ thể cho PCR. RV đa năng được làm bằng nhựa chịu nhiệt và do đó có thể được sử dụng để luân nhiệt (Hình 3).

Giao thức Roche KAPA HyperPrep: Làm sạch

Cả hai giao thức thiết bị đều thực hiện bước làm sạch dựa trên hạt từ tính. Bộ xử lý chất lỏng truyền thống yêu cầu một đĩa từ tính riêng để tách hạt. Ngược lại, Hệ thống chuẩn bị thư viện thế hệ mới Biomek NGeniuS có một trạm từ tính tích hợp trên lớp chất lỏng, loại bỏ nhu cầu thêm dụng cụ thí nghiệm (Hình 7). Do khối lượng làm sạch nhiều nên giao thức tự động hóa truyền thống yêu cầu đĩa giếng sâu. Mặt khác, Biomek NGeniuS xử lý được tới 600 µL và do đó phù hợp cho các bước làm sạch.

Giám sát trạng thái hệ thống

Bộ xử lý chất lỏng truyền thống yêu cầu người dùng kiểm tra thiết bị để theo dõi trạng thái hệ thống. Phần mềm Cổng thông tin Biomek NGenuS cho phép người dùng theo dõi trạng thái hệ thống từ bất kỳ máy tính hỗ trợ Google Chrome/Microsoft edge nào (Hình 8). Ngoài ra, Thanh ánh sáng 360° nhiều màu của Biomek NGeniuS, hiển thị trạng thái hệ thống thông qua các thay đổi về màu sắc.

Tóm tắt

Lợi ích của việc chuyển từ chuẩn bị thư viện NGS thủ công sang tự động là rất nhiều. Tự động hóa hiệu quả hơn, ít xảy ra lỗi của con người hơn (chẳng hạn như trong quá trình trộn pipet), ít bị nhiễm bẩn hơn và đáng tin cậy và nhất quán hơn. Tuy nhiên, không phải tất cả các bộ xử lý chất lỏng đều được trang bị các tính năng phần cứng và phần mềm tương tự để mang lại tất cả lợi ích của tự động hóa. Do đó, chúng tôi đã so sánh bộ xử lý chất lỏng truyền thống với Hệ thống chuẩn bị thư viện thế hệ mới của Beckman Coulter Biomek NGeniuS. So với bộ xử lý chất lỏng truyền thống, hệ thống Biomek NGeniuS có khả năng phần cứng và phần mềm cho phép người dùng tận dụng tối đa lợi ích của việc tự động hóa chuẩn bị thư viện NGS (Bảng 1)

Nguồn:

Minh Khang là nhà phân phối và nhập khẩu trực tiếp các thiết bị chuẩn bị mẫu tự động hãng Beckman Coulter.