Giới thiệu

Phương pháp đếm tế bào thủ công bằng máy đếm tế bào máu thường được coi là một phương pháp chính xác và đáng tin cậy. Tuy nhiên, có nhiều điểm khác biệt quan trọng giữa đếm thủ công và tự động có thể dẫn đến kết quả không đáng tin cậy. Phương pháp thủ công bao gồm nhiều bước dễ xảy ra lỗi, chẳng hạn như lấy mẫu chính xác, nhuộm với trypan blue và đưa vào buồng đếm, cũng như việc đếm tế bào soi dưới kính hiển vi và thiết bị đếm tế bào liên tục bằng mắt thường. Độ chính xác của việc đếm thường bị giới hạn bởi thời gian đếm một số lượng lưới nhất định trước khi tính khả dụng của tế bào bắt đầu giảm, dẫn đến tăng tính biến động và giảm độ tin cậy thống kê của kết quả. Tế bào sống và chết phải được phân biệt một cách chủ quan bởi người vận hành, điều này có thể dẫn đến kết quả không đồng nhất ngay cả trong cùng một phòng thí nghiệm (Salinas, 1997). Với máy đếm tự động, các bước lấy mẫu và nhuộm được thực hiện theo cách lặp lại và nhất quán cao, và các thuật toán đếm dựa trên hình ảnh giúp tối ưu hóa quá trình đếm. Máy phân tích khả năng sống tế bào Vi-CELL BLU cung cấp một giải pháp tự động cho việc đếm thủ công. Thiết bị chuẩn bị mẫu bằng cách nhuộm tự động với trypan blue và đưa vào buồng dòng chảy để thực hiện tạo ảnh đến 100 hình ảnh trong vòng 90 giây. Thiết bị này có thể sử dụng với cả ống riêng và đĩa 96 giếng. Thiết bị đã được chứng minh là có độ biến thiên thấp giữa các thiết bị khác nhau, như đã mô tả trong ghi chú ứng dụng “Evaluation of Instrument-to-Instrument Performance of the Vi-CELL BLU Cell Viability Analyzer”

Trong ghi chú ứng dụng dưới đây, một so sánh về số lượng tế bào và khả năng sống đã được thực hiện cho 3 dòng tế bào trên 4 thiết bị đếm tự động khác nhau từ các nhà sản xuất khác nhau so với phương pháp sử dụng máy đếm tế bào thủ công. So sánh được thực hiện bởi bên thứ ba và dữ liệu thô được cung cấp đã được phân tích bằng JMP 16.

Ba dòng tế bào và loại môi trường khác nhau được liệt kê dưới đây

Cell Line	Medium	Days of Culture
CHO K1	CDCHO + Pen-Strep	9
HEK Exip293	Expi293 + Pen-Strep	7
Sf9 ExpiSf9	Sf-900 + Pen-Strep	8

Bảng 1.  Dòng tế bào và loại môi trường.

Thiết bị đo lường và thông số kỹ thuật

Method	Cell Diameter Range	Density Range	Sample volume	Analysis time	Automated Prep	Automated Counting
XR	3-70μM	5E+04 – 1E+07	500μL	<180 sec	Yes	Yes
BLU	2-60μM	5E+04 – 1.5E+07	200μL	<130 sec	Yes	Yes
Device 2	4-70μM	1E+05 – 8E+07	400μL	228 sec	Yes	Yes
Device 1	NA	1E+04 – 1E+07	10μL	10 sec	No	Yes
Manual	NA	NA	10μL	Variable	No	No

Bảng 2.  Thiết bị và thông số kỹ thuật của thiết bị. Việc tối ưu hóa cài đặt thiết bị được thực hiện bởi đại diện của từng nhà sản xuất.

Phương pháp nuôi cấy

Các tế bào được lấy từ kho lưu trữ LN2 và được phục hồi trong 15mL môi trường trong 4-6 ngày. Sau đó, nuôi cấy trong bình 50mL trong 4-6 ngày. Tiếp theo, 4 bình được nuôi cấy ở mức 0,5e6 tế bào/mL trong 75mL môi trường.

Phương pháp lấy mẫu

Lấy 5 mL từ mỗi bình và pha loãng ở mức 10, 30, 50, 70 và 90%. Đối với mỗi loại tế bào, 3-4 bản sao cho mỗi độ pha loãng được thử nghiệm mỗi ngày trong tối đa 9 ngày.

Phương pháp thống kê

Giá trị được chia cho hệ số pha loãng để có được giá trị chưa pha loãng ước tính chuẩn. Khả năng sống được tính bằng cách chia số lượng tế bào sống cho tổng số lượng tế bào.

Các mẫu bị ô nhiễm và các mẫu có lỗi thiết bị trong quá trình phân tích không được đưa vào phân tích thống kê. Các giá trị ngoại lệ rõ ràng đã được loại bỏ thủ công khi các giá trị lệch rõ ràng so với xu hướng của toàn bộ tập dữ liệu. Ví dụ, nếu một bản sao cao hơn hoặc thấp hơn ~1,5 lần giá trị trung bình của các bản sao của cùng một mẫu. Không có giá trị ngoại lệ nào được loại bỏ thủ công khỏi số đếm thủ công do độ phân tán cao. Các giá trị có số đọc khả năng sống dưới 70% trong Ngày 1-6 đã được loại bỏ. Tổng cộng 42 giá trị ngoại lệ đã được loại bỏ khỏi tập dữ liệu gồm 2240 điểm dữ liệu.

Kết quả phân tích biến thiên

Hình 1.  Tổng số tế bào (TCD).

Hình 2.  Số lượng tế bào sống (VCD).

Hình 3.  Tỷ lệ sống

Hình 1-3.  Sự thay đổi của kết quả (lên đến 4 lần lặp lại) theo ngày (7-9) và phương pháp (5). Dữ liệu được chuẩn hóa theo mật độ mẫu ban đầu ước tính bằng cách chia kết quả cho hệ số pha loãng.

Hệ số thay đổi cho các bản sao được thể hiện dưới dạng phần trăm (%CV): Kết quả trung bình được tính trung bình qua các ngày theo dòng tế bào

Hình 4.  Kết quả %CV trung bình cho TCD, VCD và % khả thi theo phương pháp và loại tế bào. CV (%) là giá trị %CV trung bình trong tất cả các ngày cho từng loại tế bào

Kết luận

Giá trị được chia cho hệ số pha loãng để có được giá trị chưa pha loãng ước tính chuẩn. Khả năng sống được tính bằng cách chia số lượng tế bào sống cho tổng số lượng tế bào.

Dựa trên các kết quả được trình bày, Máy phân tích khả năng sống của tế bào Vi-CELL BLU sẽ là sự lựa chọn tối ưu cho việc đếm tế bào khi xem xét sự thay đổi giữa các phép đo. Sự thay đổi thấp giữa các lần lặp lại qua nhiều ngày và các dòng tế bào, cùng với việc tiết kiệm thời gian chạy mẫu, khiến máy phân tích Vi-CELL BLU trở thành một thiết bị giá trị để theo dõi sức khỏe tế bào trong các ứng dụng xử lý sinh học như sản xuất vi-rút và kháng thể.

%CV bản sao thấp có thể có lợi cho việc xác định giá trị mục tiêu một cách nhất quán mà không cần phải chạy quá nhiều bản sao. Đối với các ứng dụng có thông lượng cao và trung bình, việc tiết kiệm thời gian và tự động chạy các mẫu thay thế thay vì các bản sao quá mức có thể giảm chi phí liên quan đến tình trạng thiếu hiệu quả. Hơn nữa, sự thay đổi tương đối giữa các thiết bị, Vi-CELL BLU có thể xem như một thiết bị phù hợp để theo dõi quy trình dựa trên tế bào khi cần các thiết bị trên nhiều vị trí. Với máy phân tích khả năng sống của tế bào Vi-CELL BLU, các nhà nghiên cứu có thể tự tin đưa ra các quyết định quan trọng dựa trên kết quả nhất quán khi theo dõi sức khỏe tế bào.

Tài liệu tham khảo

1. Salinas, M et al. Ann Rheum Dis. Oct 1997; 56(10): 622-626. Comparison of manual and automated cell counts in EDTA preserved synovial fluids. Storage has little influence on the results.

2. Beckman Coulter. 2019. Application Note. Evaluation of Instrument to Instrument Performance of the Vi-CELL BLU Cell Viability Analyzer.

Nguồn: