Kích thước mẫu:  Các phép tính nhấn mạnh tầm quan trọng của kích thước mẫu khi cố định mô. Một mẫu vật  không được dày quá 4 mm . Lý tưởng nhất là một lát cắt dày 3 mm sẽ mang lại khả năng cố định và xử lý tuyệt vời. Cần lưu ý là khoang chứa mẫu trong cassette xử lý tiêu chuẩn có độ sâu 5 mm.

Tỷ lệ thể tích:  Điều quan trọng là phải có một lượng lớn chất cố định so với tổng thể tích mô vì với chất cố định phụ gia, nồng độ hiệu quả của thuốc thử sẽ cạn kiệt khi quá trình cố định diễn ra và với tổng thể tích nhỏ, điều này có thể ảnh hưởng đến chất lượng cố định. Tỷ lệ cố định trên mô là 20:1 được coi là tỷ lệ thấp nhất có thể chấp nhận, nhưng tỷ lệ mục tiêu tốt nhất là 50:1 .

Độ pH và chất đệm:  Ở mức độ kính hiển vi ánh sáng, độ pH của chất cố định dường như không ảnh hưởng nhiều đến chất lượng bảo quản vì một số công thức có độ pH khá thấp, chẳng hạn như những công thức có chứa axit axetic hoặc axit picric. Tuy nhiên, độ pH có thể quan trọng vì những lý do khác như trong trường hợp dung dịch formaldehyde, trong đó sự phân hủy formaldehyde để tạo thành axit formic tạo ra dung dịch axit, dung dịch này phản ứng với hemoglobin để tạo ra sắc tố giả (axit formaldehyde hematin). Do đó, dung dịch formaldehyde phổ biến nhất được sử dụng hiện nay được đệm ở độ pH 6,8 – 7,2 vì lý do này. Đối với kính hiển vi điện tử, pH quan trọng hơn và phải phù hợp với pH sinh lý.

Độ thẩm thấu:  Hiệu ứng thẩm thấu do chất cố định gây ra một lần nữa quan trọng hơn ở cấp độ siêu cấu trúc so với cấp độ kính hiển vi huỳnh quang vì màng phospholipid dễ bị tổn thương do dung dịch ưu trương hoặc nhược trương quá mức, nhưng độ thẩm thấu có liên quan nhất định trong thói quen mô bệnh học. Nói chung, độ thẩm thấu của chất dẫn (đệm) là quan trọng nhất và trong một số công thức, độ thẩm thấu này được điều chỉnh để giống với độ thẩm thấu của dịch mô (ví dụ formalin trong nước muối đẳng trương). Trước khi quá trình cố định xảy ra, các tế bào chắc chắn có thể bị hư hỏng bởi chất lỏng không đẳng trương như nước và nếu mẫu vật không thể được cố định ngay lập tức thì chúng có thể được giữ ẩm bằng gạc ngâm trong nước muối đẳng trương trong một thời gian ngắn. Không nên ngâm mô trong nước muối trong thời gian dài.

Có một số thuốc thử có thể được sử dụng để cố định mô. Formaldehyd, cho đến nay là tác nhân phổ biến nhất được sử dụng cho mô bệnh học và glutaraldehyde, được sử dụng rộng rãi cho các nghiên cứu siêu cấu trúc cần kính hiển vi điện tử.

Formaldehyd:  Formaldehyde (CH ₂ O) là aldehyd khí duy nhất được hòa tan trong nước đến bão hòa ở mức 37% – 40% w/v. Dung dịch này thường được gọi là “dung dịch formaldehyde đậm đặc” hoặc “formalin”. Để cố định, một phần formalin thường được pha loãng với chín phần nước hoặc dung dịch đệm. Điều này tạo ra dung dịch formalin 10% chứa khoảng 4% formaldehyde w/v, nồng độ tối ưu để cố định. Trong dung dịch đậm đặc, formaldehyde tồn tại ở dạng monohydrat methylene glycol và ở dạng hydrat polyme có trọng lượng phân tử thấp. Ở dạng pha loãng, monohydrat chiếm ưu thế. Paraformaldehyde, một dạng formaldehyde được polyme hóa cao có thể lắng đọng dưới dạng kết tủa trắng trong dung dịch formaldehyde đậm đặc. Để ngăn chặn điều này, một lượng nhỏ metanol (lên tới 15%) thường được thêm vào các dung dịch độc quyền. Paraformaldehyde có thể được mua dưới dạng bột khô và được sử dụng để tạo ra các dung dịch formaldehyde có độ tinh khiết cao như những dung dịch cần thiết cho kính hiển vi điện tử.

Formalin không có chất đệm sẽ bị oxy hóa từ từ thành axit formic dẫn đến độ pH giảm. Trong những điều kiện này, axit formic sẽ phản ứng với hemoglobin tạo thành axit formaldehyde hematin, một sắc tố giả dạng hạt màu nâu đen được lắng đọng trong các mô giàu máu. Sắc tố này gây phiền toái vì nó có thể bị nhầm lẫn với vi sinh vật hoặc các sắc tố bệnh lý khác. Mặc dù chất màu có thể được loại bỏ khỏi các phần bằng dung dịch axit picric bão hòa trước khi nhuộm, nhưng tốt nhất là tránh hình thành nó ngay từ đầu. Vì lý do này và vì formaldehyde phản ứng hiệu quả nhất ở khoảng pH trung tính nên dung dịch formalin 10% thường được đệm ở pH 6,8 – 7,2.

Formaldehyde phản ứng với chuỗi bên của protein để tạo thành nhóm hydroxy-methyl phản ứng. Nó có thể ngấm vào protein hạt nhân và axit nucleic, ổn định vỏ protein-axit nucleic và sửa đổi các nucleotide bằng cách phản ứng với các nhóm amino tự do. Formaldehyde có thể phản ứng với một số nhóm trong lipid không bão hòa, đặc biệt nếu có mặt ion canxi, nhưng có xu hướng không phản ứng với carbohydrate. Formaldehyde có thể phản ứng với các nhóm trên lysine, arginine, cysteine, tyrosine, threonine, serine và glutamine tạo thành các phức phản ứng có thể kết hợp với nhau tạo thành cầu methylene (liên kết ngang) hoặc với các nhóm hydro. Người ta chấp nhận rộng rãi rằng việc rửa mô sau khi cố định formalin có thể đảo ngược một số phản ứng này nhưng các liên kết chéo quan trọng vẫn còn. Chính khả năng của formaldehyde trong việc bảo quản các peptit của protein tế bào đã khiến nó trở nên hữu ích như một chất cố định có mục đích chung.

Có những mối nguy hiểm rõ ràng liên quan đến việc sử dụng formaldehyde làm chất cố định qua tiếp xúc với da, mắt hoặc qua đường hô hấp. Nó gây kích ứng, ăn mòn và có thể gây dị ứng. Từ năm 1981, formaldehyde đã được liệt vào danh sách “được dự đoán là chất gây ung thư ở người” và vào năm 2011, danh sách này đã được nâng cấp thành “được biết đến là chất gây ung thư ở người”. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng formaldehyde gây ung thư vòm họng, ung thư xoang và bệnh bạch cầu dòng tủy. Vì những lý do này ở hầu hết các quốc gia đều có những hướng dẫn nghiêm ngặt nhằm hạn chế việc người lao động tiếp xúc với formaldehyde tại nơi làm việc. Ví dụ: ở Hoa Kỳ, giới hạn phơi nhiễm cho phép của OSHA (PEL) là 0,75 ppm (TWA 8 giờ) và giới hạn phơi nhiễm ngắn hạn (STEL) là 2 ppm (phơi nhiễm 15 phút) và những khuyến nghị này được hỗ trợ bởi chương trình giám sát thường xuyên. Trong phòng thí nghiệm được trang bị tốt với thiết bị hút khói hiện đại, các mức mục tiêu này không được vượt quá.

Bất chấp những rủi ro khi sử dụng formaldehyde, hầu hết các nhà nghiên cứu đã xây dựng các mô bình thường và mô bị bệnh bằng cách xem xét các mẫu cố định bằng formalin. Tuy nhiên, thuốc thử này được nhận thấy là rất độc hại, nhiều phòng thí nghiệm đã tìm kiếm và đang tiếp tục tìm kiếm một giải pháp thay thế an toàn hơn. Các chất thay thế cho formalin thường được đánh giá dựa trên khả năng tạo ra hình ảnh hình thái tương tự, nếu không nói là tốt hơn so với hình ảnh do formalin tạo ra và cho phép thực hiện đầy đủ các phương pháp nhuộm bao gồm cả phương pháp phân tử và chi phí tương đương. Hầu hết các phòng thí nghiệm tiếp tục sử dụng formalin vì họ không thể tìm được chất thay thế hợp lý nên điều quan trọng là nhân viên phải nhận thức được những mối nguy hiểm liên quan.

Glutaraldehyde:  Glutaraldehyde hoặc glutaric dialdehyd (CHO(CH ₂ ) ₃ CHO) Được coi là một aldehyd hai chức năng, sở hữu các nhóm aldehyd ở hai đầu của phân tử có khả năng phản ứng với các nhóm hóa học giống như formaldehyde. Chúng sẽ tạo thành các hợp chất bổ sung và cầu nối methylene nhưng cũng có một phân tử glutaraldehyde có thể tạo thành các liên kết chéo trực tiếp nếu sự sắp xếp không gian của các peptide liền kề cho phép điều đó. Các nhóm amino của lysine đặc biệt quan trọng về mặt này. Mô được cố định bằng glutaraldehyde sẽ có liên kết ngang rộng hơn so với mô được cố định bằng formalin và cũng sẽ có một số nhóm aldehyd không phản ứng, trừ khi bị chặn về mặt hóa học, có thể gây nhuộm màu nền trong các phương pháp như PAS. Liên kết ngang rộng rãi ảnh hưởng bất lợi đến việc nhuộm hóa mô miễn dịch nhưng lại mang lại khả năng bảo quản siêu cấu trúc tuyệt vời, điều này giải thích việc sử dụng rộng rãi nó như một chất cố định chính cho kính hiển vi điện tử. Phản ứng liên kết ngang của glutaraldehyde phần lớn là không thể đảo ngược. Glutaraldehyde thẩm thấu rất chậm và khuyến cáo rằng mô có độ dày dưới 1 mm ở ít nhất một chiều.

Glutaraldehyde sẽ phân hủy từ từ để tạo thành axit glutaric và cũng sẽ polyme hóa để tạo thành các hợp chất tuần hoàn và oligomeric. Do đó, glutaraldehyde thu được tốt nhất trong các ống kín ở dạng thuận tiện “ổn định cho kính hiển vi điện tử” và chất này có thể được thêm vào dung dịch đệm thích hợp ở pH 7,2 – 7,4 (thường là cacodylate, phosphate hoặc maleate) để tạo ra nồng độ glutaraldehyde 3% để sử dụng. Đối với kính hiển vi điện tử, quá trình cố định sơ cấp glutaraldehyde thường được theo sau bởi quá trình cố định thứ cấp trong osmium tetroxide. Glutaraldehyde thường không được sử dụng cho mô bệnh học thường quy.

Nguồn: